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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：534發(fā)布時(shí)間：2011-9-26
系統(tǒng)預(yù)試法——應(yīng)用一些簡(jiǎn)單的定性試驗(yàn)，對(duì)中藥中所含各類化學(xué)成分作全面檢查。
單項(xiàng)預(yù)試法——根據(jù)需要，有重點(diǎn)的檢查某類成分或某藥效成分。
方法：試管反應(yīng)+薄層層析檢查
中草藥主要來(lái)源于植物。植物的化學(xué)成分較復(fù)雜，有些成分是植物所共有的，如纖維素、蛋白質(zhì)、油脂、淀粉、糖類、色素等。有些成分僅是某些植物所*的，如生物堿類、甙類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等。
各類化學(xué)成分均具有一定的特性，一般可由藥材的外觀、色、嗅、味等作為初步檢查判斷的手段之一。如藥材樣品折斷后，斷面不油點(diǎn)或擠壓后有油跡者，多含油脂或揮發(fā)油；有粉層的多含淀粉、糖類；嗅之有特殊氣味者，大多含有揮發(fā)油、香豆精、內(nèi)酯；有甜奈者多含糖類；味若者大多含生物堿、甙類、苦味質(zhì)；味酸者含有有機(jī)酸；味澀者多含有鞣質(zhì)等等。
中草藥所含化學(xué)成分均為多類的混合物，分析時(shí)常常互相干擾，不易得到正確結(jié)果。因此需根據(jù)中草藥所含各種化學(xué)成分的溶解度、酸堿度、極性等理化性質(zhì)，再用各類成分的鑒別反應(yīng)加以鑒別。
一、 預(yù)試溶液的制備
1、 水提取液——糖、多糖、有機(jī)酸、皂苷、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)……
2、 乙醇提取液——酚類、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、香豆素、強(qiáng)心苷、黃酮、蒽醌、甾體……
3、 5%HCl-乙醇提取液——生物堿
4、 石油醚提取液——甾體、萜類、脂肪油……
（一）鑒別注意事項(xiàng)
1．根據(jù)各灰成分不同性質(zhì)，選用適宜的溶劑提取，以保證等成分能被提取出來(lái)。
2．檢品提取液的濃度應(yīng)足以達(dá)到各該反應(yīng)的靈敏度。
3．檢品提取液的酸堿度（pH）值應(yīng)不致影響鑒別反應(yīng)中所需要的pH值。相差甚大時(shí)應(yīng)事先調(diào)節(jié)。
4．提取液較深時(shí)，常易影響觀察鑒別反應(yīng)的效果，此時(shí)可適當(dāng)稀釋，或進(jìn)一步提純。
5．鑒別反應(yīng)時(shí)應(yīng)注意防止多類成分的相互干擾，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性，或顏色不正等情況。在化學(xué)鑒別的同時(shí)，做空白試驗(yàn)和對(duì)照試驗(yàn)（用已知含某類成分的中草藥或純品做陽(yáng)性對(duì)照）。
6．在鑒別試驗(yàn)中，如果某一類成分的幾個(gè)鑒別反應(yīng)結(jié)果不一致時(shí)（即有的呈陽(yáng)性反應(yīng)，有的呈陰性）則應(yīng)進(jìn)行全面分析。首先應(yīng)注意呈陽(yáng)性反應(yīng)的試驗(yàn)是否屬于該類成分的專一反應(yīng)，否則應(yīng)檢查其他類成分能否產(chǎn)生該反應(yīng)，從多方面加以判斷。但也應(yīng)注意，某些反應(yīng)只能對(duì)某一類成分中的某個(gè)化學(xué)基團(tuán)呈性反應(yīng)，如檢查黃酮類的鹽酸――鎂粉試驗(yàn)，它只對(duì)黃酮類中的羥基黃酮類（黃酮醇類）反應(yīng)明顯，其余類的黃酮類則不甚明顯，但也不能輕易否定不是黃酮類，為了避免孤立和片面的下結(jié)論，一定要全面考慮綜合分析。
中草藥化學(xué)成分一般鑒別試驗(yàn)屯只是一個(gè)初步判斷，zui后確證尚需進(jìn)一步提純，以鑒定后才能予以肯定。
（二）鑒別方法
1、 氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)
（1）加熱沉淀試驗(yàn)：加熱煮沸 →混濁或沉淀 （蛋白質(zhì)）
+5%H2SO4（不加熱）→混濁或沉淀
（2）雙縮脲反應(yīng)：+40%NaOH，1%CuSO4 →紫色、紅色或紫紅色（多肽、蛋白質(zhì)）
（3）茚三酮反應(yīng)：+0.2%茚三酮試液 →藍(lán)或藍(lán)紫色（氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)）
（4）吲哚醌反應(yīng)：+吲哚醌試液 →各種顏色（氨基酸）
（5）Millon反應(yīng)：+Hg，H2NO2 →紅色（蛋白質(zhì)分子中有*組成）
（6）Hopkins-Cole反應(yīng)：+乙醛酸，濃硫酸 →各色（蛋白質(zhì)分子中有*組成）
（7）氨基酸的薄層層析檢查：吸附劑——硅膠G
展開(kāi)劑—— n-BuOH，n-BuOH：HAc：H2O
顯色劑——0.25%茚三酮試液 →紫紅色斑點(diǎn)
a.加熱或礦酸試驗(yàn)：取檢品的水溶液1ml于試管中，加熱至沸或加5％鹽酸，如發(fā)生混濁或有沉淀示含有水溶性蛋白質(zhì)。
b.縮二脲試驗(yàn)：取檢品的水溶液1ml，加10％氧化鈉溶液2滴，充分搖勻，逐漸加入硫酸銅試液，隨加搖勻，注意觀察，如呈現(xiàn)紫色或紫紅色示可能含有蛋白質(zhì)和氨基酸。
【注】①如檢液呈酸性，應(yīng)先堿化。 ②此反應(yīng)所產(chǎn)生的沉淀由于條件不同，其顏色也不同，質(zhì)點(diǎn)上的呈黃色，質(zhì)點(diǎn)大的呈紅色。有保持性膠體存在時(shí)，也常產(chǎn)生黃色沉淀。 ③職樣品中含有其他醛、酮及還原較強(qiáng)的其他成分，或中劃藥制劑中附加的抗氧劑、；葡萄糖等均可顯陽(yáng)性反應(yīng)。
2、α萘酚試驗(yàn)（Molisch紫環(huán)反應(yīng)）：取檢品的水溶液1ml，加5％萘酚試液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5－6滴濃硫酸，使成兩液層，待2－3分鐘后，兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)（糖、多糖或甙類）。
多糖類遇濃硫酸被水解成單糖，單糖被濃硫酸脫水閉環(huán)，形成糠醛類化合物，在濃硫酸存在下與α萘酚發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，生成紫紅色縮合物。
【注】①甙的分子結(jié)構(gòu)中含有糖基，一般屬于單糖類，如葡萄糖，鼠李糖、半乳糖，但也有含二分子糖（雙糖）或多分子糖（多糖）。在上述反應(yīng)條件下，甙被水解成單糖，因此甙萘酚試驗(yàn)，系分子中糖部分的反應(yīng)。 ②由于此反應(yīng)較為靈敏，如有微量濾紙纖維或中草藥粉末存在于溶液中，都能產(chǎn)生上述反應(yīng)。故濾過(guò)時(shí)應(yīng)加注意。
3、多糖的確證試驗(yàn)：取檢品的水溶液5ml于水蒸發(fā)至干，加入1ml蒸餾水，再加入乙醇5ml，如出現(xiàn)沉淀，濾過(guò)收集后用少量熱乙醇洗滌，再將沉淀物溶于3ml蒸餾水中，做下例試驗(yàn)。
①碘試驗(yàn)：取檢品的不溶液1ml，加碘試液1滴，觀察顏色變化，如呈藍(lán)黑色為地衣糖；紫黑色為糊精；藍(lán)色加熱消失，冷后藍(lán)色再現(xiàn)為淀粉。
②多糖水解：取檢品的水溶液1ml，加入*5滴，置沸水浴中加熱10－15分鐘，然后用10％氫氧化鈉液中和至中性，再加新配制的堿性酒石酸銅試淮4滴，另取檢液1ml，不加酸水解直接加入上述試液4滴，兩管同置水浴上煮沸5－6分鐘。如果水解后生成棕紅色常常物的量比未經(jīng)水解的多，則示有多糖。
多糖水解后產(chǎn)生單糖，利用單糖的還原性，使銅離子還原成氧化亞銅。
4、 酚類和鞣質(zhì)
（1）FeCl3試劑：+1%FeCl3試液 →藍(lán)、暗綠或藍(lán)紫色
（2）三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑：噴灑→藍(lán)色斑點(diǎn)
（3）*-鹽酸試劑：噴灑 →紅色（*、間苯三酚）
（4）重氮鹽試劑：+對(duì)硝基苯胺、* →紅色
（5）薄層層析檢查：吸附劑——硅膠G或纖維素
展開(kāi)劑—— n-BuOH：HAc：H2O；15%HAc
顯色劑——1% FeCl3試液
1%三氯化鐵-1%鐵氰化鉀試液 →藍(lán)、綠或黑色
鞣質(zhì)與酚類的區(qū)別：+明膠 —— 沉淀
上清液 +1%FeCl3試液 →藍(lán)、暗綠或藍(lán)紫色
（1）三氯化鐵試驗(yàn)：取檢品的水溶液1ml，加三氯化鐵試液1－2滴，呈現(xiàn)綠色、污綠色、藍(lán)黑色或暗紫色（可水解鞣質(zhì)顯藍(lán)一藍(lán)黑色，縮合鞣顯綠色一污綠色）。
鞣質(zhì)均是多羥基酚的衍生物，即多元酚，能和三價(jià)鐵離子發(fā)生顏色反應(yīng)生成復(fù)雜的絡(luò)鹽。
【注】此反應(yīng)如遇有礦酸或有機(jī)酸、醋酸鹽等存在，能阻礙顏色的生成。硝基酚類對(duì)三氯化鐵試劑無(wú)明顯反應(yīng)。
（2）明膠試驗(yàn)：取檢品的水溶液1ml，加氯化鈉明溶液2－3滴，即生成白色沉淀物。
鞣質(zhì)有凝固蛋白的性能。
（3）溴試驗(yàn)：取檢品的水溶液1ml，加溴試液1－2滴，生成白色或沉淀物，示可能含有酚或兒茶酚鞣質(zhì)。
【注】過(guò)多的溴會(huì)阻礙鞣質(zhì)的沉淀，因此溴水不宜多加。
（4）*一酸試驗(yàn)：取檢品的水溶液點(diǎn)于濾紙片上，干后，噴霧或滴加*一鹽酸試液，呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)（多元酚類物質(zhì)）。
（5）鞣質(zhì)、酚類薄層層析檢出反應(yīng)：
①吸附劑：聚酰胺；硅膠；硅膠；石膏：水（5：1：7）調(diào)成狀，涂成薄板，1050烘干45分鐘。
②展開(kāi)劑：乙醇：醋酸（100：2）；正丁醇：乙酸乙酯：水（5：4：1）；苯：甲醇（95：5）。
③顯色劑：10％三氯化鐵溶液；1％三氯化鐵乙醇溶液與1％鐵氰化鉀水溶液（1：1）顯藍(lán)一紫色斑點(diǎn)。
5．黃酮及其甙類
（1）鹽酸-鎂粉反應(yīng)：+HCl-Mg →紅色
（2）三氯化鋁反應(yīng)：+AlCl3 →黃色
（3）濃氨水反應(yīng)：+NH3 →亮黃或橙色
（4）薄層層析檢查：吸附劑——聚酰胺或硅膠G
（1）鹽酸一鎂（或鋅）粉試驗(yàn)：取檢品的乙醇溶液1ml，加放少量鎂粉（或鋅粉），然后加濃鹽酸4－5滴，置沸水浴中加熱2－3分鐘，如出現(xiàn)紅色示有游離黃酮類或黃酮甙（以同法不加鎂或粉做一對(duì)照，如兩管都顯紅色則有花色素存在。如繼續(xù)加碳酸試液使成堿笥即變成紫色雙轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，即證明含花色素）。
黃酮類的乙醇溶液，在鹽酸存在的情況下，能被鎂粉還原，生成花色甙元而呈現(xiàn)紅色或紫色反應(yīng)（個(gè)別為淡黃色、橙色、紫色或藍(lán)色）。這是由于酮類化合物分子中含有一個(gè)堿性氧原子，致能溶于稀酸中被還原成帶四價(jià)的氧原子即鋅鹽。本法是鑒別黃酮類的一個(gè)反應(yīng)。但花色素本身在酸性下（不需加鎂粉）呈紅色，應(yīng)加以區(qū)別。
【注】①此反慶僅在化學(xué)結(jié)構(gòu)中，第三位上帶羥基的酮醇類顯色較明顯，而其它黃酮烷酮類均不甚明顯。因此試驗(yàn)呈陰性反慶是不能做出否定的結(jié)論，尚需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)再做結(jié)論。 ②試驗(yàn)應(yīng)在醇中進(jìn)行，水分多會(huì)影響顏色的生成。此反慶較慢，有時(shí)需置水浴上加熱，以促使反應(yīng)的進(jìn)行。
（2）熒光試驗(yàn)：
①三氯化鋁試驗(yàn)：取檢品的乙醇溶液點(diǎn)于濾紙片上（干后再點(diǎn)1次，使其濃度庥中），干后，噴霧1％三氯化鋁乙醇試液，在紫外光燈下觀察，呈現(xiàn)黃色、綠色、橙色等熒光為黃酮類；呈現(xiàn)天藍(lán)色或黃綠色；熒光，則為二氫黃酮類。這是區(qū)別二氫黃酮類化合物的一種鑒別反應(yīng)。
②硼酸丙酮枸櫞酸丙酮試驗(yàn)：取檢品的乙醇溶液1ml，在沸水浴上蒸干加入飽和硼酸丙酮溶液及10％枸櫞酸丙酮溶液各0.5ml，蒸去丙酮后，在紫外光燈下觀察，管內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光（黃酮或其甙類）。
（3）堿液試驗(yàn)：取檢品的乙醇溶液點(diǎn)于濾紙片上（干后，再點(diǎn)一次，使其溶液集中），干后，噴1％碳酸鈉溶液或在氨蒸氣中熏幾分鐘，呈現(xiàn)亮黃、綠或橙黃色。如將氨氣熏過(guò)的濾紙露置空氣中，顏色逐漸裉去而變?yōu)樵械念伾S酮或其甙類）。
6、生物堿
（1）沉淀反應(yīng)——碘化汞鉀試劑 →白色或淺黃色沉淀
碘化鉍鉀試劑 →橘紅色沉淀
碘—*試劑 →淺棕或暗棕色沉淀
硅鎢酸試劑 →淺黃或黃棕色沉淀
磷鎢酸試劑 →淺黃色沉淀
磷鉬酸試劑 →白色或淡黃色沉淀
苦味酸試劑 →黃色結(jié)晶或非結(jié)晶形沉淀
鞣酸試劑 →棕黃色沉淀
氯化金試劑 →黃色結(jié)晶
氯化鉑試劑 →白色結(jié)晶
雷氏銨鹽 →紅色無(wú)定形沉淀
（2）薄層層析檢查：吸附劑——堿性氧化鋁（Ⅲ級(jí)，干法鋪板）
硅膠G（稀堿濕法鋪板）
展開(kāi)劑——氯仿：甲醇
顯色——UV；碘化鉍鉀
7、 有機(jī)酸
（1）PH試紙檢查
（2）溴酚蘭試液：噴灑→藍(lán)色背景黃色斑點(diǎn)
（3）薄層層析檢查：吸附劑——硅膠G或酸性氧化鋁
展開(kāi)劑—— C6H6：EtOH
顯色劑——0.1%溴酚蘭試液→黃色
8、甾體
（1）Lieberman—Burchard反應(yīng)：+醋酐-濃硫酸 →黃-紅-紫-污綠
（2）氯仿-濃硫酸反應(yīng)：+氯仿-濃硫酸 氯仿層→紅或青色
硫酸層→綠色熒光
（3）五氯化銻或三氯化銻反應(yīng)：+SbCl3或SbCl5 →紅色
（4）薄層層析檢查：吸附劑——中性氧化鋁或硅膠G
展開(kāi)劑—— C6H6-MeOH；CHCl3-MeOH
顯色劑—— 10%磷鉬酸 →藍(lán)-藍(lán)紫色
5%三氯化銻試液 →紅、棕紅或綠色
9、香豆素、內(nèi)酯
（1）開(kāi)閉環(huán)反應(yīng)：+1%NaOH→澄清 +2%HCl→混濁
（2）異羥污酸鐵反應(yīng)：+7%鹽酸羥胺、10%KOH △ +稀HCl、1%FeCl3 →紅色
（3）重氮鹽試劑：+對(duì)硝基苯胺、* →紅色
（4）薄層層析檢查：吸附劑——酸性硅膠G或硅膠G 或酸性氧化鋁
展開(kāi)劑—— 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）
顯色劑—— UV→藍(lán)色熒光
異羥污酸鐵試液 →紅色
10、強(qiáng)心苷
（1）Kedde試劑：+3，5-二硝基苯甲酸試液 →紫紅色
（2）Baljet試劑：+堿性苦味酸試液 →橙或橙紅色
（3）Legal試劑：+亞硝酰鐵氰化鈉試液 →紫紅色
（4）K-K反應(yīng)：+FeCl3/冰HAc、濃H2SO4→ 上層綠~藍(lán)色 （2-去氧糖）
界面紅棕色
（5）薄層層析檢查：吸附劑——硅膠G 或中性氧化鋁
展開(kāi)劑—— n-BuOH：HAc：H2O（4：1：5）
顯色劑—— 堿性3，5-二硝基苯甲酸試液→紫紅色
堿性苦味酸試液 →橙紅色
11、蒽醌
（1）堿液反應(yīng)：+10%NaOH →紅色 +H2O2 →紅色不褪 +H+ →紅色褪去
（2）醋酸鎂反應(yīng)：+1%MgAc2 →紅色
（3）薄層層析檢查：吸附劑——硅膠G
展開(kāi)劑——Pet：EtOAc
顯色劑—— UV→黃色熒光
5%NaOH →紅色
12、揮發(fā)油、油脂
（1）油斑檢查：油斑揮發(fā) →揮發(fā)油； 油斑不消失→油脂或類脂
（2）磷鉬酸反應(yīng)：噴灑5%磷鉬酸試液 →藍(lán)色（油脂、三萜、甾醇）
zui后重點(diǎn)提醒：以上各試劑的配制方法參照藥典來(lái)配制，原因一是上面寫(xiě)得很詳細(xì)，二是藥典中有個(gè)規(guī)定，藥典上配制的溶液要是要用到乙醇的，如果沒(méi)有用無(wú)水乙醇，一般是要用95%的乙醇的。
另外附一個(gè)試劑的配法：
氯化鈉明膠試劑：（兩者都是固體，剛開(kāi)始我還真不知道怎樣配，后來(lái)在藥典才發(fā)現(xiàn)配方）2g氯化鈉和1g明膠，再加上100g水，要求是現(xiàn)配的！
商鋪：http://www.kindlingtouch.com/st32881/
主營(yíng)產(chǎn)品：ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，豚鼠ELISA試劑盒，兔ELISA試劑盒，羊ELISA試劑盒，牛ELISA試劑盒，雞ELISA試劑盒，鴨ELISA試劑盒，植物ELISA試劑盒
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