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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：398發(fā)布時間：2012-2-16
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1. 初步掌握從血清中提取純化IgＧ的方法步驟。
2. 了解辛酸－硫 酸銨法純化IgG 的原理。
二、實(shí)驗(yàn)原理
辛酸—硫 酸銨法分兩步進(jìn)行。*步用辛酸沉淀雜蛋白，辛酸為短鏈脂肪酸，在酸性條件下可沉
淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig 蛋白質(zhì)；第二步利用硫 酸銨鹽析將Ig 沉淀下來，操作步驟如圖3
－10所示。經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測能得到電泳純度較高的Ig。
三、儀器、原料和試劑
儀器
磁力攪拌器、離心機(jī)、低溫冰柜。
原料
抗血清(兔抗雞血清)
試劑
1. 乙酸—乙酸鈉緩沖液：60mmol/L，pH4.0
2. 10×磷酸鹽-NaCl 緩沖液(PBS):100mmol/LPBS，pH7.4。稱NaCl 80g、Na2HPO4 12H2O 29g、KCl 2g 、KH2PO4 2g，加蒸餾水溶解，加入100mmol/LEDTA 20m1，用去離子水定容至l000mL。
3. 透析液 10mmoL／L Na2HPO4- KH2PO4緩沖液，含15mmol/LNaCl，pH7.2。
4. 硫 酸銨
5. 辛酸
四、操作步驟
1.抗血清用4倍體積乙酸—乙酸鈉緩沖液稀釋，用0.1mol/LNaOH 調(diào)至血清稀釋液為pH4.5；
2.室溫下邊攪拌(磁力攪拌器或電功攪拌器)，邊緩慢滴加辛酸(25mL/L 血清稀釋液)，滴加完后繼續(xù)攪拌30min。
3.離心(10000r/min，30min)，收集上清夜，棄去沉淀；
4.上清液用多層紗布過濾；
5.按l/10體積加入10×PBS，用5mol/LNaOH 調(diào)至PH7.4。
6.上清液4℃預(yù)冷，計(jì)算溶液總體積，在4℃按277g/L 加入硫 酸銨粉沫(45％飽和度)，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌30min。
7.離心(5000r/min、15min)，棄去上清液。收集沉淀。
8.沉淀用少量透析液溶解(一般為血清體積的1/10)，透析并更換兩次透析液或用Sephadex G-50脫鹽。
9.Ig 溶液在50~55℃水浴中加熱20min，離心(5000r/min，20min)， 上清液-20℃保存或凍干保存。
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