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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：538發布時間：2011-4-15
隨著科學技術的發展和生活水平的不斷提高對生物醫藥產品的質量要求也越來越高，所以對制備工藝中所涉及到的各種原材料的質量標準要求也越來越高，特別是對用于細胞培養基中的主要天然成份――牛血清的質量要求也不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。（一）、WHO公布的《用動物細胞體外培養生產生物制品規程》中的要求：
1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。
2.有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。
3.證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。
4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。
5.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。
6.對細胞有良好的支持繁殖作用。
（二）、我國在對牛血清的質量2000年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。
（三）、美國對牛血清的質量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，他們對其質量標準要求都極為嚴格，從血清來源到產品質量都有明確規定。
1） 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質量標準和美國*進口要求。地方當局還不清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗結果和交付情況。
2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10個月內）血清靜脈取血。血清采集條件必須符合工業生產的標準：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅活。
3）血清的制備：
a. 超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量減到zui低，一般IgG≤5ug/ml，生物學活性不變。
b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧化酶／過氧化酶方法測定）。
c. γ－射線照射：已經證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30～45KG。而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質和對細胞培養的影響。
4）除菌過濾:經過上述處理的粗制血清再經過一系列除菌濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜。
4.終產品血清質量
1）化學檢定：滲透壓
pH
蛋白含量――電泳法
白蛋白 球蛋白 血紅蛋白
隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應增加，總的血清蛋白含量可以確定產品規格和年齡。
2） 微生物學檢查：細菌、真菌符合USP標準。
支原體：在支原體專業培養基上培養了3～4周，培養溫度36℃±2℃分別在需氧和厭氧條件下進行，有的還需要在支原體瓊脂培養皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養法無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。
病毒檢查：
牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛細小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼腸弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza
檢查方法：
已證明無外源因子污染的牛細胞培養物，在細胞生長液中加15％待測血清，連傳3代共21天。陰性對照細胞培養液中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行。在觀察期內注意細胞形態變化或細胞病變。在觀察期內第14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。
如待檢細胞培養物經*消化后分種到6個含蓋玻片的容器內。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養物蓋玻片容器內作為陽性對照，再培養7天，用熒光抗體技術進行檢查。
細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養瓶用人“O”紅細胞、豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在2～8℃和20～24℃進行。陰性對照細胞預先感染副流感Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。
3）內毒素檢測
用鱟試劑檢查。
4）細菌噬菌體檢查
主要檢查E.Coli（C300 or K-12）噬菌體。
5）激素含量測定
每批FBS對某些激素含量都要進行測定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。
6）血紅蛋白檢測
血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％，血紅蛋白含量≤mg15/dl。
7）細胞生長效果測定
a.細胞克隆效果測定
細胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清濃度與細胞數:
10％血清／1個細胞／孔
4％血清／5個細胞／孔
細胞培養基RPMI－1640， 96孔培養盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養10～15天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。
克隆效率計算：
克隆效率＝（陽性孔平均數/ 培養孔總數） X100％
相對克隆效率＝待測血清克隆效率/參考血清克隆效率
b.貼壁效率試驗：
用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應出低濃度血清的貼壁變化。采用6孔培養盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數即10％血清――100細胞／孔，4％血清200介細胞／孔。放36℃±2℃，濕潤5％二氧化碳培養箱培養10～14天，計算著色細胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。
貼壁效率（％）＝（每孔克隆平均數/ 每孔活存的培養細胞平均數） X100％
相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率
c. 二倍體纖維細胞促生長試驗
*株 WI28 MRc5
25cm2細胞培養瓶，5％血清，每瓶接種1.5X105細胞連傳3代，每代血清濃度和接種細胞數相同，每代培養7天，每代接種二個細胞瓶，36℃±2℃培養。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養。每代收獲細胞計數，計算每批待檢血清與參考血清的相對生長率（RGR）。
RGR＝（試驗血清每瓶細胞平均數/ 參考血清每瓶細胞平均數） X100％
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