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上海酶聯生物研究所
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閱讀：1738發布時間：2010-4-28
液相色譜柱（HPLC）及相關方法
HPLC是一種比較傳統的方法，能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]報道。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5mC/（5mC 5C）的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測DNA甲基化的標準方法。但它需要較精密的儀器。Fraga等2002年[19]運用毛細管電泳法（HPCE）處理DNA水解產物，以確定5mC的水平。與HPLC相比，HPCE更加簡便、快速、經濟。HPLC及HPCE測定基因組整體DNA甲基化水平的敏感性均較高。Oefner等1992年[20]提出變性液相色譜法（DHPLC）用于分析單核苷酸和DNA分子。鄧大君等2001[21]將其改進與PCR聯用建立了一種檢測甲基化程度的DHPLC分析方法。將重亞硫酸鹽處理后的產物進行差異性擴增，由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時仍被保留為胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR擴增時，其變性溫度也相應上升，使PCR產物在色譜柱中保留的時間明顯延長，這樣就可以測定出PCR產物中甲基化的情況。
這種方法的zui明顯優點是：可用于高通量混合樣本檢測，能夠明確顯示目的片段中所有CpG位點甲基化的情況，但不能對甲基化的CpG位點進行定位。
2.1.2SssI甲基轉移酶法[22]
SssI甲基轉移酶能夠催化DNA的CpG位點發生甲基化。3H-S-腺苷*（3H-SAM）在SssI甲基轉移酶催化作用使基因組DNA的CpG位點發生甲基化。通過測定剩余的放射性標記的SAM即可得到原基因組整體甲基化水平，即測到的放射性強度與所測DNA甲基化水平成反比。這種方法的缺點是所使用的SssI甲基轉移酶不穩定，致結果不夠。
2.1.3免疫化學法[23]
這種方法是基于單克隆抗體能夠與5mC發生特異性反應。應用熒光素標記抗體使之與預先已固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結合，對DEAE膜上的熒光素進行掃描得到5mC的水平，其熒光素強度與5mC水平成正比。Oakeley等1997年[23]報道了這種方法。這種方法需要精密的儀器。
2.1.4氯乙醛法
Oakeley等1999年[24]首先描述了這種使用氯乙醛和熒光標記的方法。首先，將DNA經重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉變為*，而甲基化的胞嘧啶保持不變（Frommer等1992年）[25]，然后經過銀或色譜柱去除DNA鏈上的嘌呤，再將樣品與氯乙醛共同孵育，這樣5mC就轉變為帶有強熒光的乙烯胞嘧啶，熒光的強度與原5mC的水平成正比。這種方法可以直接測定基因組整體5mC水平。其優點是所用試劑價格低廉且穩定性好，避免了放射性污染，但缺點是費時費力，而且氯乙醛是一種有毒的物質。
2.2特異性位點的DNA甲基化的檢測
2.2.1甲基化敏感性限制性內切酶（methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法
這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaⅡ-MspⅠ（識別序列CCGG）和SmaⅠ-Xmal（CCCGGG）等。由于后者識別的堿基數相對較多，其堿基序列在體內出現的概率相對較低，所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能識別CCGG序列，然而當序列中的胞嘧啶發生甲基化時，HpaⅡ不切割，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態[12][26]。
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