科捷色譜儀教程-LC600液相色譜儀分離原理解析 ：
液—液分配色譜法（Liquid-liquid Partition Chromatography）及化學(xué)鍵合相色譜（Chemically Bonded Phase Chromatography）
流動(dòng)相和固定相都是液體。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí)，服從于液相色譜計(jì)算公式：
液相色譜計(jì)算公式式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動(dòng)相對K影響不大，LLPC流動(dòng)相對K影響較大。
a. 正相液 — 液分配色譜法（Normal Phase liquid Chromatography）: 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性。
b. 反相液 — 液分配色譜法（Reverse Phase liquid Chromatography）: 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。
液—固色譜法
流動(dòng)相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 （X） 和溶劑分子（S）對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm
式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子。
當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K為吸附平衡常數(shù)。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法（Ion-exchange Chromatography）
IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流離子交換色譜柱動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-（溶劑中） （樹脂-R4N Cl-）=== （樹脂-R4N X-） Cl- （溶劑中）
當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)：
KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]
分配系數(shù)為：
DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關(guān)系]
凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。
離子對色譜法（Ion Pair Chromatography）
離子對色譜法是將一種 （ 或多種 ） 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 （ 稱為對離子或反離子 ） 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原離子色譜儀流程示意理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機(jī)相.
式中：X 水相--流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基*銨等）；X Y---形成的離子對化合物。
當(dāng)達(dá)平衡時(shí)：
KXY = [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相[Y-]水相
根據(jù)定義，分配系數(shù)為：
DX= [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相
離子對色譜法（特別是反相）發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。
離子色譜法（Ion Chromatography）
用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。
以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程）：
擔(dān)體圖示抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：
R-H Na OH- === R-Na H2O
R-H Na Br- === R-Na H Br-
可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。
離子色譜法是溶液中陰離子分析的*方法。也可用于陽離子分析。
空間排阻色譜法（Steric Exclusion Chromatography）
空間排阻色譜法以凝膠 （gel） 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值zui大，在色譜圖上zui后出現(xiàn)。
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