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*瓊脂糖凝膠使用說明

最近更新時間：2011-4-22

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Pgex載體表達的外源蛋白與*S-轉移酶溶合，因此可以通過*-瓊脂糖親和層析進行純化。Pgex是一類以*（γ-*半胱胺酰*）作為底物，通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對底物的親和力是亞豪摩爾級的，因此*固化瓊脂糖形成的親和層析樹脂GST及其融合蛋白的純化效率很高?？梢杂煤坞x*的緩沖液洗脫結合GST融合蛋白。樹脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。
*瓊脂糖對GST融合蛋白的結合能力很強（每毫升柱床體積的樹脂能結合8毫克融合蛋白）。
*樹脂的處理
1. 輕輕顛倒盛有*-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿
2. 取部分勻漿放入15ml聚丙烯管（每100ml 細菌培養(yǎng)物需要2ml勻漿）
3. 4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
4. 在樹脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒數(shù)次，混合均勻，4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
5. 每毫升樹脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用
制備細胞抽提物
6. 每100毫升培養(yǎng)基的細胞沉淀懸于4mlPBS
7. 加入*至終濃度1mg/ml,冰上放置30分鐘
8. 用針筒將10ml 0.2%TritonX-100 強行注入黏的細胞裂解物中，劇烈振動數(shù)次均勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/ml,4℃振動溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細胞碎片，上清轉移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L
純化融合蛋白
9. 細胞裂解物與適量50%*-瓊脂糖樹脂勻漿混合，每100毫升細菌培養(yǎng)物加2ml樹脂，于室溫輕搖30min
10. 混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
11. 沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白。
12. 4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
13. 重復步驟11和12兩次
14. 合的GST融合蛋白可用*洗脫緩沖液洗脫，也可用*、腸激酶或Xa因子切割，
用*洗脫融合蛋白
a. 沉淀中加入1倍柱床體積的*洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結合的蛋白。
b. 如步驟12離心，上清（含洗脫的融合蛋白）移至管中。
c. 重復步驟a和b，合并三次上清。
蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上揮手靶蛋白
a. 在結合了融合蛋白的樹脂中加入*、腸激酶或Xa因子（根據(jù)融合蛋白中的位點選擇），每ml樹脂加入50單位溶于1mlPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2-16小時。用小規(guī)模試驗確定時間。
b. 4℃以500g離心5分鐘，上清小心移至新管中。（GST仍結合在樹脂上，而靶蛋白也在上清中，仍需要奮力）
15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質組成
試劑配制
*洗脫緩沖液：10mmol/L還原型*
50mmol/L Tris-Cl（PH8.0）
 

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