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金葡菌特異性鑒別基因

閱讀:642發布時間:2011-5-7

在金葡菌的檢測方面,近年來很多學者逐漸探索了一些有很強特異性的鑒別基因,主要包括如下幾種。

a.耐熱核酸酶基因(heat stable nuelease,nuc)。耐熱核酸酶(thermostablenuclease,TNase)是金葡菌的特異性酶,通過檢測TNase酶活性以鑒定金葡菌通常有較好的專一性和準確性,但也存在一些非金葡菌株可檢測到該酶活性的例子,其原因尚不清楚,可能是由于其可產生與TNase活性相似的酶。編碼酶蛋白的nuc基因已全部定序。通過nuc基因的特異擴增來檢測金葡菌已被證實具有非常好的特異性,避免了檢測酶活時出現的假陽性現象,有很好的應用前景。揚州大學比較醫學中心高正琴、邢華等通過擴增rlUC基因可以在4h內檢測到zui低3pg DNA或5個金葡菌,并由此制備了特異性探針,檢測靈敏度達lpg DNA,符合率為100%。

b.staphopainA/B。saphopains是一種與葡萄球菌致病性相關的、外分泌型半*蛋白水解酶,包括蛋白水解酶A和蛋白水解酶B兩種,分別由基因scpA和sspB編碼。GolonkaE等通過PCR-RFLP技術對126株臨床分離金葡菌進行了研究,發現所有菌株均檢測到這兩種基因的存在,且分別分為四型和六型。Southern雜交試驗表明scpA和sspB基因在各菌株間高度保守,說明saphopains應該屬于持家基因產物且具有重要的致病性能。

c.血漿凝固酶(eoagulase)基因。大多數致病性葡萄球菌產生此酶,而非致病性菌一般不產生,因此,該酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標。凝固酶有兩種:一種是分泌至菌體外的蛋白質稱為游離凝固酶(free coagulase);另一種結合于菌體表面并不釋放,稱為結合凝固酶(boundcoagulase)或凝聚因子(clumping factor)。游離凝固酶采用試管法檢測,結合凝固酶則以玻片法測定。凝固酶耐熱,粗制品加熱至100~C經30rain或高壓滅菌后仍保持部分活性(staphylococcusbacteriaintroduce);凝固酶基因曾被認為是鑒定金葡菌的特異性基因,但后來發現有少數金葡菌并不產生凝固酶,且一些凝固酶陰性菌也有很強的致病性,且因具有過高的多態性而更多地應用于金葡菌的分子分型技術。

d.16SDNA、23SDNA及間隔序列23SRNA和168RNA分別為構成核糖體大、小亞基的重要組分,它們的基因即23SDNA和16SDNA在分類學的種間有高度的保守性,常可用來作為特異序列鑒定菌種屬。J.丸Straub等以23S DNA為靶基因,通過PCR技術檢測了肉類產品發酵劑及乳制品中的S.aulelgs,通過選擇性前增菌過程,可在大量雜菌存在的背景下于12h內檢測到10CFU濃度的目的菌,進而通過嵌套PCR技術可使檢測極限下降一個數量級;翟俊輝等建立了以細菌16SDNA為對象的基因芯片技術,在4.5h內的純細菌培養液中能檢測到235個菌體的金葡菌;同時,一種通過對168rDNA擴增引物3’端單堿基錯配來鑒定S.aUreUS的策略也具有很好的效果。rRNA雜交試驗在檢測金葡菌時表現出良好的特異性,但對臨床樣品的檢測中缺乏很好的靈敏性而限制了它的應用。

e.轉錄調控基因。D·Liu等報道了對S.aureus中編碼轉錄調控因子的基因進行分析,發現了兩個特異性片段Sa0836和Sa0856,并分別設計相應引物進行PCR,結果表明該序列對S.aureus具有明顯的特異性,可檢測所有待測的23株金葡菌,而其他類型葡萄球菌及常見菌均無此基因,表明該基因有很好的鑒別特異性。

f.Sma I限制性酶切片段特異序列。一段44kb的Sma I序列被證實為金葡菌特異性序列。J.Stepan等將13株不同類型的金葡菌菌株基因組的EcoR工酶切片段與Sma工序列雜交,發現了在所有菌株中均存在一段2052bp的特異序列,通過設計引物,在待測的216株金葡菌中均特異性擴增出826bp片段,而其他陰性對照菌均無該特異片段。

g.基因組特異性插入片段。Francis Martineau等在廣泛分析了金葡菌基因組文庫后得到一段442bp的、編碼未知功能的特異性插入片段,通過PCR擴增在所有待測82株金葡菌中,均表現出特異性結果,而在其他類型葡萄球菌及非葡萄球菌致病菌中均未擴增,特異性強,操作簡便,耗時短(僅1h)。

 


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