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上海源葉生物科技有限公司
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閱讀:582發(fā)布時間:2011-4-6
診斷時zui重要的步驟是選擇合適的樣品,這樣才能獲得有用的實驗室資料。一般來講,從幼豬而非大豬中采集樣品,因為在幼豬中的PRRSV的數(shù)量多,持續(xù)時間長。感染后4—6周能從乳豬、斷奶仔豬或架子豬的血清中分離血清。病毒分離用的樣品在采集后迅速冷藏或凍貯,因為PRRSV對病毒很敏感,在運輸過程中必須注意溫度不能升高,否則PRRSV易被滅活而不能進行病毒分離。此外,病毒對pH的穩(wěn)定性范圍很小,因此必須保證無菌環(huán)境,以避免細菌污染而導致pH改變。樣品必須用絕緣和防漏的容器包裝,有足夠的冷凍劑,迅速遞送到相關實驗室對PRRS的病毒學診斷比較困難,這主要由于分離病毒需要選用豬肺泡巨噬細胞,這種細胞來自6~8周齡的豬,并且是無特定病原體豬(SPF)這種豬不是所有實驗室都可以方便得到的。一般的傳代細胞系對該病毒的易感性差,不能*替代肺泡巨噬細胞。某些猴腎細胞系(MARC-145)能較好的替代巨噬細胞,但不支持所有的分離物,尤其是對歐洲型毒株。
鑒定PRRSV的實驗室技術還有免疫組化和免疫熒光方法,其中以肺和扁桃體組織用于檢測效果較好,這兩種方法比用病毒分離方法更迅速且無需細胞培養(yǎng)設施。免疫組化法可以對用福爾馬林固定的組織塊病毒鑒定,并能對病毒進行溯源性分析,但這兩種方法的正確性受操作人員的技巧影響很大,再經病毒分離或PCR鑒定應用原位雜交法能檢測和區(qū)別PRRS病毒北美洲基因型及歐洲株基因型,但它主要用于研究,并不適于實驗室診斷。
反轉錄—聚合酶聯(lián)反應(RT—PCR)以及套式PCR法檢測病毒RNA的敏感性很高,當病毒分離困難時很有用,如測定精液或病毒因為自溶而部分降解。在豬的急性感染中,PCR與常規(guī)病毒分離同等敏感,在感染的康復階段比病毒分離更為敏感。自動化的PCR試驗不易發(fā)生污染,為診斷實驗室提供敏感而特異的試驗,而且費用大為下降。現(xiàn)在已廣泛用于包括血清在內的多種組織的檢測;現(xiàn)已發(fā)展了多種PCR診斷技術,其中嵌套式PCR比普通PCR提供了更高的敏感性,多重PCR可以用于區(qū)別北美型和歐洲型PRRS病毒分離株;現(xiàn)在更新的熒光定量RT—PCR技術也已經用于組織或血清樣本中PRRSV的定性和定量檢測。通過這些分子生物學的方法,我們可以在難以進行病毒分離的情況下快速準確地檢測病原。zui近,開發(fā)的PCR產物進行限制性片段長度多態(tài)性分析的方法,可用于PRRS野毒株以及疫苗分離株的分子流行病學檢測。
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