作為新一代基因組編輯技術(shù)先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學(xué)家用以了解細(xì)菌免疫力的技術(shù)方法在過(guò)去的5年里，研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學(xué)研究的有力工具。近期來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校，霍德華休斯醫(yī)學(xué)院等處的研究人員破解了關(guān)鍵酶Cas9識(shí)別全基因組中靶標(biāo)的重要機(jī)制，這將有助于更有效的完善CRISPR基因編輯技術(shù)。
這一研究成果公布在11月12日Science雜志上。
領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna教授，Doudna教授與Emmanuelle Charpentier 2012年在Science雜志上發(fā)表的一項(xiàng)論文中指出，細(xì)菌用以對(duì)抗病毒的CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以作為簡(jiǎn)單、靈活的基因組編輯工具，由此她倆獲得了生命科學(xué)突破獎(jiǎng)（Breakthrough Prize in Life Sciences）。
在研究CRISPR序列過(guò)程中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)許多與這些序列功能存在關(guān)聯(lián)的核酸酶或螺旋酶, 統(tǒng)稱(chēng)為CRISPR-相關(guān)因子(CRISPR-associated, Cas), 這也就是CRISPR-Cas系統(tǒng)的由來(lái)。
其中，具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas蛋白是細(xì)菌獲得抗性，催化DNA剪切的關(guān)鍵所在，但是至今為止我們對(duì)于這種酶如何在這么龐大的全基因組中進(jìn)行搜尋，如何跳過(guò)那些“無(wú)用"的序列，找到靶標(biāo)序列的機(jī)制知之甚少。
在這篇文章中，研究人員利用時(shí)差單分子成像技術(shù)（time-lapsed single molecule）追逐了活體小鼠細(xì)胞中的Cas-9蛋白，然后用這一數(shù)據(jù)計(jì)算Cas9蛋白保持穩(wěn)定的概率。
Cas9蛋白作用需要crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA：tracrRNA/crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)其在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。Cas9核酸酶有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：RuvC和HNH。當(dāng)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域激活時(shí)，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補(bǔ)鏈， RuvC結(jié)構(gòu)域剪切非互補(bǔ)鏈，在基因組上產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。
在追蹤過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)Cas9行動(dòng)非?？欤谝幻氩坏降臅r(shí)間里就能鑒別基因序列是不是靶標(biāo)，而且雖然Cas9能快速分散到整個(gè)基因組大部分區(qū)域內(nèi)，但是在稠密的異染色質(zhì)DNA中，Cas9速度會(huì)降低，這些區(qū)域也就是緊密包裝的染色質(zhì)區(qū)域，經(jīng)常出現(xiàn)在細(xì)胞核的周?chē)２贿^(guò)即使在這里Cas9受到了束縛，但是仍然能結(jié)合上去。
這些發(fā)現(xiàn)揭示了Cas9蛋白在基因組中進(jìn)行搜尋的機(jī)制，表明Cas9的快速“跳過(guò)"機(jī)制是確保CRISPR作用的前提，這一新見(jiàn)解將有助于完善CRISPR基因編輯技術(shù)。
同期Nature雜志也發(fā)表了這一研究組的相關(guān)成果：Cas9 的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象狀態(tài)直接控制了DNA切割活性。
在這篇文章中，研究人員提出了一個(gè)模型：Cas9核酸內(nèi)切酶利用了多個(gè)層次的調(diào)控來(lái)確保切割靶DNA。除了通過(guò)PAM結(jié)合及在sgRNA–DNA互補(bǔ)基礎(chǔ)上定向解旋DNA識(shí)別潛在靶序列，識(shí)別靶DNA序列驅(qū)動(dòng)了HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生了構(gòu)象改變。這一結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變觸發(fā)了RuvC結(jié)構(gòu)域催化活性，確保了協(xié)調(diào)切割兩條DNA鏈。部分互補(bǔ)的脫靶DNA序列或許可以穩(wěn)定結(jié)合Cas9，但卻無(wú)法驅(qū)動(dòng)HNH構(gòu)象改變，從而避免的切割。
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