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ELISA方法檢測牛分枝桿菌抗體研究及應用
E LI sA 診斷抗原選擇結核分枝桿菌特異性抗原M p B s 3、M p B 7 o、e F P l o 和E s A T 一6 是近幾年討論和研究的熱點, 被認為是比較有希望的牛結核病特異性診斷候選抗原。
這些抗原用于E U S A 檢測結核病的研究還不多。M P B 70 是牛分枝桿菌感染過程中重要的體液和
細胞免疫目標抗原, 可作為牛分枝桿菌感染的診斷試劑1201。但由于M P B 70 是B c G 中的一種重要成分,因此不能區分自然感染和B C G 免疫。已有的報道顯示,M P B 70 用于E LI s A 檢測牛結核病的特異性可達90 % 以上, 而敏感性卻很不穩定7[, “ ,。M P B 83 是牛分枝桿菌表面相關的分泌型脂蛋白, 在牛分枝桿菌中高水平表達, 但在結核分枝桿菌中很少表達l2l]。據報道, M p B 83 能夠檢測出結核病牛, 并能區分出B c G 免疫牛l2]。M P B 83 檢測結核牛血清抗體有較高的特異性, 但敏感性卻有爭議9l[。sE A 6T 和c F 1P 0 是結核分枝桿菌早期分泌蛋白〔23] ,由于他們只存在于結核分枝桿菌復合群及其它幾種致病性分枝桿菌中, 且都在卡介苗中缺失, 因此有望成為鑒別診斷候選抗原。用E S A T一6 檢測結核病牛血清抗體敏感性和特異性分別達到了98.6 % 和98.5 % 81[。c FlP o 檢測抗體的特異性也很高, 但單獨用c F P 10 作為抗原檢測結核抗體敏感性很低【’ 01。E s A T 一6 和c F P 10 重組抗原的運用不僅可以提高結核檢測的敏感性「川, 而且能用于鑒別卡介苗免疫與臨床自然感染工25]。
E LI s A 方法二十多年前就已經被用于結核病的診斷, 然而多年來一直沒有得到推廣應用, 主要原因是其特異性、敏感性和穩定性都不十分令人滿意。我們選用上述3 種結核菌特異性抗原, 有望提高E lL s A 診斷方法的特異性和敏感性, 為我國牛結核病的臨床診斷提供。3.2 E U S A 條件的改進比較已報道的E l S A 檢測方法, 本研究擯棄了二抗稀釋液中牛血清白蛋白(B S A ) 的使用, 排除了B S A 對E U S A 檢測的可能干擾[ ’ 9] , 同時提高了酶標二抗的使用效率, 在不影響檢測結果的條件下, 將酶標二抗的稀釋倍數從l : 2 0 0 0 0 提高到l : 10 0 0 0 0。3.3 E LI S A 的敏感性和特異性由于結核菌素皮內變態反應( T s )T 是oI E 及我國的牛結核病檢疫的推薦方法, 因此, 本研究用T S T 作為標準評價E LI S A 的敏感性。細菌學檢查雖是結核病診斷的標準, 但檢出率低, 檢測條件要求高, 因此, 我們在本試驗室開展細菌分離試驗, 只是借助武漢市結核病防治院(所) 的條件, 做了小范圍的細菌分離鑒定, 以證實E IL s A 檢測的準確性。結果表明, 用E LI S A 方法同時檢測3 種蛋白的血清抗體, 其與T S T 的陽性符合率或敏感性可達70.4 %。由于抗體陽性與病程成正比, 推測E LI S A 檢測強陽性牛可能出現臨床或病理癥狀, 因此, 進一步分菌鑒定, 結果證實了5 頭牛為細菌分離陽性。實驗室買下了其中一頭, 解剖發現了典型的結核病病理變化(資料未顯示)。對5 頭細菌分離陽性牛進行T S T 檢測, 結果3 頭陽性, 2 頭可疑, 進一步證實, E LI S A 方法的可靠性較高, 檢測重度感染牛具有更高的敏感性。同時, 檢測結果表明, E LI S A 并不能包含全部的T S T 陽性牛, 而T S T 也不能包含全部的E IL S A陽性牛, 這一點與機體抗結核菌的免疫規律是一致的。早在19 7 7 年,eL nz in 26[] 等就發現了結核病的細胞免疫與體液免疫分離的現象, 并指出細胞免疫在感染早期出現, 隨病情加重而減弱, 體液免疫隨病情加重而增強。因此, E IL S A 抗體檢測有利于檢出與淘汰危險性大的嚴重感染牛。此外, T s T 與E IL s A 結果的差異還可能與T S T 存在嚴重的非特異性反應[ ’ 〕及因機體免疫力底下而引起的假陽性反應’ 2 , ’ 有關。特異性試驗結果表明, 本研究建立的ElL s A 方法與牛的5 種主要病原無血清學交叉反應, 顯示出良好的特異性。至于該E LI S A 方法能否鑒別診斷其他分枝桿菌感染及B C G 免疫還有待進一步驗證。綜上所述, 本研究所建立的間接E LI S A 方法可有效檢測幾種牛結核病特異蛋白的抗體, 在初步應用中表現了良好的敏感性和特異性。由于抗體陽性與牛結核病的病程呈正相關, 而皮內變態反應與病程呈負相關, 因此檢測抗體的間接E u s A 方法與皮內變態反應具有較強的互補性。由于抗體檢測省時省力, 易實現自動化與程序化, 在我國及世界上部分發展中國家的牛結核病嚴重流行地區, 檢測抗體的間接E U S A 方法應當具有重要的應用價值
