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植物體內的可溶性蛋白質大多數是參與各種代謝的酶類,測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標。在研究每一種酶的作用時,常以比活(酶活力單位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制劑純度。因此,測定植物體內可溶性蛋白質是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍G-250染料結合法。本實驗將分別介紹這兩種方法。
一、考馬斯亮藍法
【原理】
考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在游離態下呈紅色,當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色,前者zui大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白質濃度范圍內(0~100μg/ml),蛋白質-色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速,其結合物在室溫下1h內保持穩定。該反應非常靈敏,可測微克級蛋白質含量,所以是一種比較好的蛋白質定量法。
【儀器與用具】
分光光度計,10ml量筒1支;研體;10ml容量瓶1支;1ml刻度吸管3支;10ml具塞刻度試管14支。
【試劑】
(1)牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml;
(2)考馬斯亮藍G-250:稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,zui后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個月;
(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%,W/V)。
【方法】
1.標準曲線的繪制
(1)0~100μg/ml標準曲線的制作 取6支試管,按表28-1數據配制0~100μg/ml血清白蛋白液各1ml。準確吸取所配各管溶液0.1ml,分別放入10ml具塞試管中,加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑,蓋塞,反轉混合數次,放置2min后,在595nm下比色,繪制標準曲線。
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