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微生物的染色方法很多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數(shù)過多聚成集團(tuán)，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。
2、自然干燥
涂片在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。
3、固定
標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個：
１）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。
３）改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。
固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3~4次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。
以上這種固定法在微生物實驗室中雖然應(yīng)用較多普遍，但是應(yīng)當(dāng)指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采用化學(xué)固定法。化學(xué)固定法zui常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1~2%的餓酸等。餓酸能很快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，所以比較常用。應(yīng)用餓酸固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，在毛細(xì)管中注入少量的1~2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，經(jīng)過1~2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，并使之干燥。
4、染色
標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時間各不相同，視標(biāo)本與染料的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標(biāo)本的時間平均約1~3分鐘，而所有的染色時間內(nèi)，整個涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。若作復(fù)合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細(xì)菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結(jié)合固定或染色同時進(jìn)行。
５、脫色
用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色。可檢查染料與細(xì)胞結(jié)合的穩(wěn)定程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。
６、復(fù)染
脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅zui后進(jìn)行染色，就是復(fù)染。
７、水洗
染色到一定的時候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
８、干燥
著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。
９、鏡檢
干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀察。
綜上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脫色→復(fù)染→水洗→干燥→鏡檢。
