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基 本 方案 1 蛋白質(zhì)或多糖抗原體內(nèi)法誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生

材 料

人外周血

類毒素混合物： 25Lf U/ml 白 喉 類 毒 素（Connaught Laboratories 或 State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 與 IOLf U/ml 破 傷 風(fēng) 類 毒 素（State Laboratoriy Institute of Massachusetts) 的混合物

多價(jià)肺炎球菌疫苗（如 Pneumovax 23、 Merck 或 Pnu-Immune 23、 Lederle)

皮下注射器和酒精棉球

1 . 采集 正 常 人 外 周 血（附 錄 3 G ) ，血凝后，離心分離血清，一 20?一 70°C 保存

2 . 用皮下注射器肌注（三頭肌或大腿肌肉）〇 .5m l 類毒素混合物，注意避開(kāi)血管。注射 后 24 h 內(nèi)應(yīng)密切觀察，防止過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生（盡管少見(jiàn)），出現(xiàn)情況及時(shí)處理。

3 . 或者皮下注射〇 .5m l 多價(jià)肺炎球菌疫苗。注 射 后 應(yīng)密切觀察，出現(xiàn)情況及時(shí)處理(曾經(jīng)接受疫苗注射的人發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的概率增加）。

4.免疫后di 1、 2 和 3 周采血。若只采血一次，可在免疫后di 2 周采血。檢 測(cè) IgM 時(shí)，應(yīng)在免疫后di 3?7 天采血。分離血清后，血清置一 20?一 70°C 保存。

5.E L I S A 法檢測(cè)樣品中抗體的含量（見(jiàn)基本方案 2)。

基 本 方 案 2 ELISA 法檢測(cè)體內(nèi)抗體的產(chǎn)生

材 料

碳酸鹽緩沖液， P H 9. 6 或 PBS (見(jiàn)相關(guān)手冊(cè)）

抗原：白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、 I 或 II 型肺炎球菌多糖或蛋白質(zhì)偶聯(lián)的 III 型

肺 炎 球 菌 多 糖（見(jiàn)輔助方案）

NaN3，推薦使用

Tween/P B S : 含 0 •0 5 % (VTV) Tween 20 的 PBS (4 〇 C 可儲(chǔ)存 1 月）

含 1 % ( V A O 胎 牛 血 清（fetalcalfserum， F C S , 56°C ， Ih 滅 活 ）或含 0.1%(m /V ) B S A 的 P B S ，推薦使用

血清標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清，避免反復(fù)凍融

F C S /Tween/P B S : 含 0.1% F C S (56°C ， Ih 滅活）的 Tween/PBS

堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase， A P ) 標(biāo)記的二抗：特異性針對(duì)人抗體的 K 和入輕鏈，以及抗人 IgG、 I g A 和 IgE 抗 體（Tago)

底物，新 鮮 配 制（每 板 需 6m l 左右）

3mol/L N a O H

破傷風(fēng)類毒素和白喉類毒素標(biāo)準(zhǔn)品

9 6 孔平底培養(yǎng)板及蓋子（Costar)

半自動(dòng)或全自動(dòng)洗板儀（Dynatech)

酶聯(lián)儀

1 . 取 9 6 孔板，預(yù)留di一列作為空白對(duì)照，在余下的每列中間隔（如 di 2、 4、 6、 8、 10列）加 入 150M1 碳 酸 鹽 緩 沖 液（檢測(cè)類毒素抗原）或 PBS (檢測(cè)多糖抗原）。

2 . 用碳酸鹽緩沖液將白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素分別稀釋至 0. 22Lf U /m l 和 0. 56LfU /m l ; 用 P B S 將 I /I I 型肺炎球菌多糖和蛋白質(zhì)偶聯(lián)的 III 型肺炎球菌多糖分別稀釋至 0 •025m g /m l 和 1?3/^g/m l 。將稀釋的抗原各取 150^1 加入上述剩余的各縱列孔中(如di 3、 5、 7、 9、 1 1 列），置 4°C 孵育過(guò)夜。若 加 入 0 . 0 2 % N a N 3 后 ，培養(yǎng)板可保存 4 周 。

3 . 用 半 自 動(dòng) 或 全 自 動(dòng) 洗 板 儀 洗 板 3 次 ，每 次 加 入 200 Ml T w e en/P B S ，洗 板 間 隔 1?2 min。zui后拍干殘余的洗液。

4 . 備選操作：為降低非特異性結(jié)合，可 加 入 100? 150/xl 含 1 % F C S 或 0. 1 % B S A 的P B S 。室溫孵育 Ih (或 4°C 過(guò)夜），然 后 洗 板（檢測(cè)白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素抗原時(shí)不需此步驟）。

5 . 將標(biāo)準(zhǔn)血清 3 倍系列稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法如下：在 di 2?3 列的di一排孔中加入 150ul zui高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（包括抗原包被孔和抗原未包被孔）。di 2?3 列余下的孔中加入 100ulFC S /Tween/P B S 。用多道移液器從di一排的兩孔中各吸取 50M1 血清分別加入di二排的對(duì)應(yīng)兩孔中，將 血 清 進(jìn) 行 3 倍稀釋。輕輕吹打混勻后，同上依次在 di 2?3 列余下的各孔中進(jìn)行血清 3 倍系列稀釋。zui后，從zui末一排的兩孔中各吸

棄 50M1 稀 釋 的 血 清（此時(shí)所有孔的終體積為 lOOul)。

6 . 將成對(duì)的待測(cè)血清（免疫前和免疫后）稀釋后加到上述 9 6 孔板中。方法如下：在相應(yīng) 的 2 縱 列（包括抗原包被列和抗原未包被列） zui上面的兩孔中，各 加 入 150ul 稀釋后的 待 測(cè) 血 清（通 常 1 : 4 0 , 免疫后血清稀釋度可更高些）。 2 縱列余下的各孔中加 入 IOOul F C S /Tween/P B S 。參照步驟 5 將待測(cè)血清進(jìn)行 3 倍系列稀釋。

7 . 室溫孵育 2 h 或 4°C 過(guò)夜。用 Tween/P B S 洗 板 3 次 ，拍干殘余的洗液。

8 . 用 F C S /Tween/P B S 將 A P 標(biāo)記的二抗稀釋至合適濃度。用多道移液器在每孔中加入 IOOul 抗 體 。di 一 列 為 空 白 對(duì) 照 ，只 加 F C S /Tween/P B S 。室 溫 孵 育 2 h 或 4°C過(guò)夜。

9 . 加 入 Tween/PBS 洗 板 3 次 ，拍干殘余的洗液。每孔中加入 IOOmI 新鮮配制的底物溶液 ，室溫顯色。酶聯(lián)儀檢測(cè)吸光值，待標(biāo)準(zhǔn)品zui高濃度孔中的 A 4q5 吸 光 值 達(dá) 1.0 時(shí) ，在每孔中加入 lOOjul 3mol/L N aO H 終止顯色。

10 . 將數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行處理和分析。分析結(jié)果時(shí)，應(yīng)將樣品孔的吸光值減去空白對(duì)照孔的吸光值。

11 . 將待測(cè)樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值進(jìn)行比較。zhi定未稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的抗體效價(jià)為1000 抗體單位，計(jì)算出樣品的抗體單位。zui  hao能將標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照國(guó)際白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素標(biāo)準(zhǔn)品換算出國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)值，然后計(jì)算樣品值。

輔 助 方 案 肺 炎 球 菌 多 糖 與 蛋 白 質(zhì) 的 偶 聯(lián)

III 型 肺 炎 球 菌 多 糖（和其他型肺炎球菌多糖，如 6A 、 9、 1 4 和 1 9 ) 需與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后才能穩(wěn)定地吸附于固相表面，從而獲得重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此方法也可用于 I 和II 型肺炎球菌多糖與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，此時(shí)，多糖抗原的劑量應(yīng)減少 5?1 0 倍 。

材 料

指示液

氰尿酰氯結(jié)晶

0.1% ( m A O 多 聚 賴 氨 酸（相對(duì)分子質(zhì)量 30 000?70 000; Sigma)

III 型肺炎球菌多糖

PBS

1 . 取 3 支 試 管 ，標(biāo) 記 為 A 、 B 和 C 。在 A 管 中 加 入 0.5m l 指示液•，在 B 管中加入0.5m g 氰尿酰氯結(jié)晶；在 C 管中加入 0.1 ml 0.1% (m /V ) 多聚賴氨酸。

2 . 用水將肺炎球菌多糖抗原稀釋至 l m g /m l 。在 A 管 中 加 入 0.1m l 稀釋后抗原，混勻IOs (溶液呈粉紅色）。將 A 管中的液體移入 B 管 ，混 勻 IOs ( 當(dāng) p H 降 至 8.0?8. 2 時(shí) ，溶液變無(wú)色）。 然 后 將 B 管中的液體移入 C 管 。混勻后， 4 °C 結(jié) 合 2 h。

3 . 用 P B S 將肺炎球菌多糖抗原稀釋至 2?5 ug/ml (可 獲 得 100 Mg 偶合抗原）。