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技術文章

人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒Hsp60

閱讀:142發(fā)布時間:2016-3-1

人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關液體中人熱休克蛋白60(Hsp60)含量。

實驗原理

熱休克蛋白60(HSP60)是一類進化上高度保守的蛋白質(zhì)家族生理狀態(tài)時協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉位、折疊和裝配,,起“分子伴侶的作用;在應激狀態(tài)下,HSP60過表達或異位表達,作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識別,誘發(fā)機體的保護性免疫應答,也可作為一種信號分子,在信號轉導中發(fā)揮作用.近年來研究證實HSP60在自身免疫性疾病、傳染病、動脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用。

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本HSP60水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原、*化的抗人HSP60抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。 

 

試劑盒組成及試劑配制 

  • 酶聯(lián)板:一塊(96孔) 
  • 標準(凍干品)2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為10000 pg/mL,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成10000 pg/mL,5000 pg/mL ,2500 pg/mL,1250 pg/mL,625 pg/mL,312 pg/mL,156 pg/mL,其原液直接作為zui高標準濃度,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制5000 pg/mL標準品:取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

  • 樣品稀釋液:1×20ml/
  • 檢測稀釋液A1×10ml/
  • 檢測稀釋液B1×10ml/
  • 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
  • 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
  • 底物溶液:1×10ml/瓶。 
  • 洗滌液1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
  • 終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 

 

標本的采集及保存 

1.細胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標本保存于-20℃,且應避免反復凍融

2.血清:標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,但避免反復凍融。

3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標本放于-20℃保存,但避免反復凍融。

注:標本溶血會影響zui后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

 

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

  • 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外,余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,輕輕混勻,酶標板加上蓋,37反應120分鐘
  • 棄去液體,甩干,不用洗滌。
  • 每孔加檢測溶液A工作液 100ul37℃,60分鐘。洗板3次,350ul/每孔,甩干。 
  • 每孔加檢測溶液B工作液 100ul,3760分鐘,洗板5次,甩干。
  • 依序每孔加底物溶液90ul37℃避光顯色30分鐘(此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯)。
  • 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(此時蘭色立轉黃色)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值) 

1. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 

2.為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人HSP60,且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。 

注意事項

  • 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
  • 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
  • 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。
  • 如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。

6.底物請避光保存。

檢測范圍:

156 pg/mL -10000 pg/mL

說明 

1.試劑盒保存:-20(較長時間不用時);2-8(頻繁使用時)。

2.有效期:6個月

3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正常現(xiàn)象,不會對實驗結果造成任何影響。 

5.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。

 

 


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