人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關液體中人熱休克蛋白60（Hsp60）含量。
實驗原理
熱休克蛋白60（HSP60）是一類進化上高度保守的蛋白質(zhì)家族。生理狀態(tài)時協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉位、折疊和裝配,，起“分子伴侶”的作用；在應激狀態(tài)下，HSP60過表達或異位表達,作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識別，誘發(fā)機體的保護性免疫應答，也可作為一種信號分子，在信號轉導中發(fā)揮作用.近年來研究證實HSP60在自身免疫性疾病、傳染病、動脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用。
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中HSP60水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原、*化的抗人HSP60抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
- 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
- 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 pg/mL標準品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
- 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
- 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
- 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
- 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
- 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
- 底物溶液：1×10ml/瓶。
- 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
- 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應避免反復凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
- 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鐘。
- 棄去液體，甩干，不用洗滌。
- 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
- 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
- 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
- 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人HSP60，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
- 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
- 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
- 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
- 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
156 pg/mL -10000 pg/mL
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
