人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中人熱休克蛋白60（Hsp60）含量。
實(shí)驗(yàn)原理
熱休克蛋白60（HSP60）是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族。生理狀態(tài)時(shí)協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配,，起“分子伴侶”的作用；在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP60過表達(dá)或異位表達(dá),作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識別，誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，也可作為一種信號分子，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用.近年來研究證實(shí)HSP60在自身免疫性疾病、傳染病、動脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用。
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中HSP60水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原、*化的抗人HSP60抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
- 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
- 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
- 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
- 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
- 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
- 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
- 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
- 底物溶液：1×10ml/瓶。
- 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
- 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存
1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
- 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。
- 棄去液體，甩干，不用洗滌。
- 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
- 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
- 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
- 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
特異性
本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人HSP60，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
- 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
- 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
- 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
- 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
156 pg/mL -10000 pg/mL
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。
2．有效期：6個(gè)月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
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