豬基質金屬蛋白酶（MMP-9）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究研究使用
預期應用
ELISA法定量測定豬血清、血漿、唾液、細胞培養物上清或其它相關液體中MMP-9含量。
概述
MMP-9基因位于染色體20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13個外顯子和9個內含子。哺乳類動物MMP-9mRNA的同源性約為80%。MMP-9的啟動子區內含有活化蛋白（AP）-1、AP-2和刺激蛋白（SP）-1因子結合位點，豬的MMP-9啟動子區還有核因子（NF）κB、ETS結合位點和轉化生長因子（TGF）-β抑制元件MMPs主要由3個*的、保守的結構域構成，包括前肽區（氨基末端區）、催化區和羧基末端區（類血紅素結合蛋白酶區）。MMP-9是明膠酶中的一種，除了有MMPs的原型結構外，MMP-9的催化區還包括3個重復的型纖維連接蛋白結構域，這個結構域與明膠或彈性蛋白有高度的親和力。MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結構域,這個結構域有高度的糖基化作用，,它影響底物的特異性以及有抗衰變的作用。MMP-9有許多作用底物，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型膠原、蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，細胞因子及其受體也是MMP-9作用的底物。
MMP-9是以酶原的形式從胞內分泌到胞外，在體外，MMP-9通過有機汞制劑反應才有活性，在體內則可經一系列蛋白酶級聯而激活。這個膠原蛋白結構域可被MMP-3、MMP-2或者次氯酸裂解，而不是纖維蛋白溶酶、*或者MMP-1。MMP-3可能是MMP-9zui有效的激活劑。MMP-9主要的循環抑制劑是а2巨球蛋白，活化的MMP-9被а2巨球蛋白捕獲并通過清除受體被清除出循環系統。金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）是MMPs家族的組織抑制劑，廣泛分布于組織和體液中，共價結合MMPs而抑制其活性。TIMP-1作為MMP-9的抑制劑，與MMP-9的酶原或活化后酶的催化區的羧基末端特異性結合，形成復合物，,從而特異性抑制MMP-9的活性。另外，血小板反應蛋白和蛋白酶組織抑制因子2（TFPI-2）也能抑制MMP-9的活性。
MMP-9的生理作用廣泛。MMP能分解呼吸道和肺內的結構復合物如ECM和基底膜,因此能參與呼吸道和肺的重建，它還能調節其他蛋白酶及細胞因子的活性，它能降解α1抗*，保護中性粒細胞彈性蛋白酶活性,能加強膠原質膠體中膠原細胞和MMP-13的溶膠原活動，并且MMP-9還能從白細胞介素8（CXCL8/CL8）上分解一個62氨基酸肽,使其向中性粒細胞的趨化活性增加10倍，但它也抑制其他中性粒細胞的趨化因子。此外，MMP-9結合CD44可釋放儲存的TGF-β1，另外，MMP-9可通過釋放血管內皮生長因子（VEGF）以參與血管生成。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中MMP-9水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入MMP-9抗原、*化的抗大鼠MMP-9抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MMP-9呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成
1. 酶聯板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為20000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成20000 pg/mL，10000 pg/mL ，5000 pg/mL，2500pg/mL，1250pg/mL，625 pg/mL，312.5 pg/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內配制。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4. 抗體稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 抗體稀釋液B：1×10ml/瓶。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液A1：100稀釋。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液B1：100稀釋。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標本的采集及保存
1．細胞培養物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，輕輕混勻，37℃，120分鐘。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。
4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。
5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘。
6. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應。用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
2．為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層
吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的豬MMP-9，且與其它相關蛋白無交叉反應。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1． 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2． 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。
4． 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
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