人抗血小板抗體IgM（PA-IgM）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
產品編號：CSB-E05177h
zui低檢測限：1 ng/ml
特異性：本試劑盒可檢測人PA-IgM，且與其他相關抗體無交叉反應。
有效期：6個月
預期應用：ELISA法半定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中PA-IgM含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
實驗原理
用純化的血小板裂解抗原包被酶標板，制成固相載體。向微孔中先加入待測樣品進行反應，然后再加入辣根過氧化物酶標記抗人IgM進行反應，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的PA-IgM呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數記為效價）。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
3. 辣根過氧化物酶標記抗人IgM稀釋液 （HRP-anti-human IgM Diluent）：1×10ml/瓶。
4. 辣根過氧化物酶標記抗人IgM（HRP-anti-human IgM）：1×120μl/瓶（1：100）。
5. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
6. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
7. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍，標本中抗體的效價為“N”。
辣根過氧化物酶標記抗人IgM的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標記抗人IgM稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記抗人IgM加990μl辣根過氧化物酶標記抗人IgM稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設空白孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標記抗人IgM工作液 100μl（取1μl*標記抗體加99μl*標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃，60分鐘。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。
4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見孔內有明顯藍色，即可終止）。
5. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
6. 用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標記抗人IgM工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標記抗人IgM工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
為檢測樣品中PA-IgM效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價，一般采取以1:40為起始稀釋倍數（使用樣品稀釋液進行稀釋）。zui大稀釋倍數根據客戶自身試驗要求而定，zui終顯色與陰性對照孔進行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。
5. 在配制檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。
6. 底物請避光保存。
7. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
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