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Rabbit tumor necrosis factor α  
（TNF-α） ELISA Kit
 
Catalog No. CSB-E06998Rb
（96 tests）
 
 
 
 
  This  immunoassay kit allows  for  the  in vitro quantitative determination of  rabbit
TNF-α concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. 
 
 
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INTRODUCTION
The  prototype  ligand  of  the  TNF  superfamily,  TNF-α/TNFSF1A,  is  a
pleiotropic cytokine that plays a central role in inflammation and apoptosis.
It  is  synthesized as a  26  kDa,  type  II  transmembrane protein  that  is  233
amino acids in length. It contains a 30 amino acid （aa） cytoplasmic domain,
a  26  aa  transmembrane  segment,  and  a  177  aa  extracellular  region.
TNF-αis  assembled  intracellularly  to  form  a  transmembrane,
non-covalently-linked  homotrimeric  protein.  The  157  aa  residue  soluble
form  of  TNF-α（sTNF-αis  released  from  the  C-terminus  of  the  
transmembrane  protein  through  the  activity  of  TNF-α-converting  enzyme
（TACE）,  a membrane  -bound  disintegrin metalloproteinase.  Human  cells
known  to express TNF-αinclude B  cells,  colonic  columnar epithelial  cells,
NK and CD3+CD56+ hepatic natural T cells, macrophages, monocytes and
monocyte-derived  dendritic  cells,  CD4+  and  CD8+  T  cells,  mast  cells,
neutrophils, keratinocytes, plasma cells, and adipocytes.  
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
antibody  specific  to TNF-α. Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin-conjugated  polyclonal
antibody  preparation  specific  for  TNF-α  and  Avidin  conjugated  to
Horseradish  Peroxidase  （HRP）  is  added  to  each  microplate  well  and 
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incubated. Then a TMB （3,3'5, 5'  tetramethyl-benzidine） substrate solution
is  added  to  each  well.  Only  those  wells  that  contain  TNF-α,
biotin-conjugated  antibody  and  enzyme-conjugated  Avidin  will  exhibit  a
change  in  color.  The  enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the
addition  of  a  sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is  measured
spectrophotometrically  at  a  wavelength  of  450  nm  ±  2  nm.  The
concentration of TNF-α in the samples is then determined by comparing the
O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
78  pg/ml-5000  pg/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1250 pg/ml, 625 pg/ml, 312 pg/ml,
156 pg/ml, 78 pg/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes recombinant and natural rabbit TNF-α. No significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum  detectable  dose  of  rabbit TNF-α  is  typically  less  than  19.5
pg/ml.
The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined 
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as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120l
HRP-avidin  1 x 120l
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout the
expiration date of  the kit. Refer  to  the package  label  for  the expiration
date.
2.  Opened  test  kits  will  remain  stable  until  the  expiring  date  shown,
provided it is stored as prescribed above.     
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3.  A  microtiter  plate  reader  with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3  OD  or  greater  at  450nm  wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,  warm  to
room  temperature  and  mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or
distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Reconstitute the Standard with 1.0 ml of Sample Diluent.
This  reconstitution produces a stock solution of 5000 pg/ml. Allow  the
standard to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to
making  serial  dilutions.  The  undiluted  standard  serves  as  the  high
standard  （5000  pg/ml）.  The  Sample  Diluent  serves  as  the  zero
standard （0 pg/ml）.
3.  Biotin-antibody    Dilute  to  the working concentration specified on  the
vial label using Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Dilute  to  the working concentration specified on  the vial
label using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of measuring  absorbance  at  450  nm, with 
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the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Cell Culture Supernates    Remove particulates by centrifugation and
assay immediay or aliquot and store samples at-20° C. Avoid
repeated freeze-thaw cycles.
  Serum    Use a serum separator  tube （SST） and allow samples  to clot
for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove
serum and assay  immediay or aliquot and  store  samples at-20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an
anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes
of collection. Assay immediay or aliquot and store samples at-20° C.
Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Add  100l  of  Standard,  Blank,  or  Sample  per  well.  Cover  with  the
adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37° C.   
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2.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
3.  Add 100l of Biotin-antibody working solution  to each well.  Incubate
for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  working  solution  may  appear
cloudy.  Warm  to  room  temperature  and  mix  gently  until  solution
appears uniform.
4.  Aspirate each well and wash,  repeating  the process  three  times  for a
total of three washes. Wash by filling each well with Wash Buffer （350l）
using  a  squirt  bottle,  multi-channel  pipette,  manifold  dispenser  or
autowasher.  Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to
good  performance. After  the  last wash,  remove  any  remaining Wash
Buffer  by  aspirating  or  decanting.  Invert  the  plate  and  blot  it  against
clean paper towels.
5.  Add  100l  of  HRP-avidin  working  solution  to  each  well.  Cover  the
microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hours at 37° C.
6.  Repeat the aspiration and wash three times as step 4.
7.  Add 90l of TMB Substrate  to each well.  Incubate  for 30 minutes at
37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other  temperature
fluctuations in the dark.
8.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  change  does  not
appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
9.  Determine  the optical density of each well within 30 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS 
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Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and
subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve
by reducing the data using computer software capable of generating a four
parameter  logistic  （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard
curve  by  plotting  the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis
against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the  log of  the
TNF-α concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be
determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve
be consistent with the samples being assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,
washing  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding. 
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  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble  receptors,
binding proteins, and other  factors present  in biological samples. Until
all  factors  have  been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the
possibility of interference cannot be excluded.
TECHNICAL HINTS
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.
  To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of
each standard  level, between sample additions, and between  reagent
additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period  following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary.
  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should
change from colorless to gradations of blue.
  Stop Solution  should be added  to  the plate  in  the  same order as  the
Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue
to  yellow  upon  addition  of  the Stop Solution. Wells  that  are  green  in
color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the
Substrate Solution.
 
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兔子腫瘤壞死因子 兔子腫瘤壞死因子 兔子腫瘤壞死因子 兔子腫瘤壞死因子 α（TNF-α）酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析 酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號： ：： ：CSB-E06998Rb
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：78 pg/ml - 5000 pg/ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：19.5 pg/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的兔子 TNF-α，且與其他相關蛋
白無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA 法定量測定兔子血清、血漿或其它相關生物液體中
TNF-α 含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
4.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理 
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用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 TNF-α 抗體的微孔
中依次加入標本或標準品、*化的抗 TNF-α 抗體、HRP 標記的親和素，
經過*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，
并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關。
用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。  
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯板 酶聯板 酶聯板 酶聯板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液 *標記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液（ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）：1×10ml/瓶。 
6.  *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 *標記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                         1×120l/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 辣根過氧化物酶標記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120l/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液 （ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                       1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標準規格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存  
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000 x g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍
融。 
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2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8° C
1000 x g離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復
凍融。
3.  細胞培養物上清或其它生物標本：1000 x g離心 20 分鐘，取上清即可檢
測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注 注注 注： ：： ：標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測 因此溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。
標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則 標本的稀釋原則： ：： ：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。
只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應
做好詳細的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。 
標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則 標準品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好
后靜置 10 分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 5000  pg/ml，
做系列倍比稀釋后，分別稀釋 5000  pg/ml，2500  pg/ml，1250  pg/ml，625
pg/ml，312  pg/ml，156  pg/ml，78  pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度 0
pg/ml，臨用前 15 分鐘內配制。
如配制 2500  pg/ml標準品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）5000  pg/ml的上述
標準品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以
此類推。
*標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則 *標記抗體的稀釋原則： ：： ：
臨用前以*標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所
需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如 10l 生物
素標記抗體加 990l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內配制。
辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則： ：： ：
臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的
每次實驗所需的總量配制（每孔 100l），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。如
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10l 辣根過氧化物酶標記親和素加 990l 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋
液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1.  加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100l，
余孔分別加標準品或待測樣品 100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，
37℃反應 120 分鐘。
為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標記抗體工作液  100l （取 1l
*標記抗體加 99l *標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
350l/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同*標記抗體工作液）
100l，37℃，60 分鐘。
5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
350l/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90l，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內，此時肉眼可見標
準品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加
入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底
物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.  用酶聯儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒， ，， ，但 但但 但 48T 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半 試劑盒所有試劑減半。 。。 。
2.  用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到
管底。
3.  每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
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液及 2N H2SO4。測量時先用此孔調 OD值至零。  
4.  為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上
蓋或覆膜。
5.  未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8℃保存。標準品、*標記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請
勿重復使用已稀釋過的標準品、*標記抗體工作液或、辣根過氧化物
酶標記親和素工作液。
6.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。