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Rat Cortisol ELISA Kit
 
 
 
Catalog No. CSB-E05112r
（96 tests）
 
 
 
 
 
 
 
  This  immunoassay  kit  allows  for  the  in  vitro  rapid  detection  of  rat  Cortisol
concentrations in serum, plasma.
  Expiration date    six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
 
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INTRODUCTION
Cortisol  is a  corticosteroid hormone or glucocorticoid produced
by  the adrenal cortex, which  is part of  the adrenal gland （in  the
zona fasciculata and the zona reticularis of the adrenal cortex）. It
is usually referred to as the "stress hormone" as it is involved in
response  to stress and anxiety, controlled by CRH.  It  increases
blood  pressure  and  blood  sugar,  and  reduces  immune
responses. Various synthetic forms of cortisol are used to treat a
variety of different  illnesses. The most well-known of  these  is a
natural metabolic  intermediary of cortisol called hydrocortisone.
When  first  introduced  as  a  treatment  for  rheumatoid  arthritis,
hydrocortisone was referred to as Compound E.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
This  assay  employs  the  competitive  inhibition  enzyme
immunoassay  technique.  An  anti-antibody  specific  to  the
antibody  of  cortisol  has  been  pre-coated  onto  a  microplate.
Standards  or  samples  are  added  to  the  appropriate microtiter 
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plate wells with an antibody specific for cortisol and Horseradish
Peroxidase  （HRP）  conjugated  cortisol,  then  incubated.  A
competitive  inhibition  reaction  is  launched  between  cortisol
（Standards  or  samples）  and  Horseradish  Peroxidase  （HRP）
conjugated  cortisol  with  the  antibody  specific  for  cortisol.  The
more the amount of cortisol in samples, the less antibody bound
by  Horseradish  Peroxidase  （HRP）  conjugated  cortisol.  The
substrate solutions are added to the wells, respectively. And the
color develops in opposite to the amount of cortisol in the sample.
The color development is stopped and the intensity of the color is
measured.
DETECTION RANGE
The  standard  curve  concentrations  used  for  the  ELISA’s  were
20ng/ml, 5ng/ml, 1.25ng/ml, 0.31ng/ml, 0.08ng/ml.
SPECIFICITY
This assay recognizes cortisol. No significant cross-reactivity or
interference was observed. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standards （S1-S5）  5  
Antibody  1 x 6 ml
HRP-conjugate  1 x 6 ml
Wash Buffer      
1 x 15 ml
  20×concentrate）
Substrate A  1 x 7 ml
Substrate B  1 x 7 ml
Stop Solution      1 x 7 ml
 
Standard  S1  S2  S3  S4  S5
Concentration（ng/ml）  0.08  0.31  1.25  5  20
STORAGE
1. Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt
and  the microtiter plate should be kept  in a sealed bag. The
test kit may be used throughout the expiration date of the kit,
provided  it  is  stored  as  prescribed  above.  Refer  to  the
package label for the expiration date. 
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2. Opened test plate should be stored at 2-8°C in the aluminum
foil bag with desiccants to minimize exposure to damp air. The
kits will remain stable until the expiring date shown, provided it
is stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less
and an optical density  range of 0-3 OD or greater at 450nm
wavelength  is  acceptable  for  use  in  absorbance
measurement.
TECHNICAL HINTS
1.  Bring all reagents and plate to room temperature for at least
30 minutes before use. Unused wells need store at 2-8℃and
avoid sunlight.
2. Centrifuge vials before opening to collect contents.
3. Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,
warm  to  room  temperature  and mix  gently  until  the  crystals
have  compley  dissolved.  Dilute  15  ml  of  Wash  Buffer
Concentrate into deionized or distilled water to prepare 300 ml
of Wash Buffer. 
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4.  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips  between
additions of each standard  level, between sample additions,
and between reagent additions. Also, use separate reservoirs
for each reagent.
5. When using an automated plate washer, adding a 30 second
soak  period  following  the  addition  of  wash  buffer,  and/or
rotating  the  plate  180  degrees  between  wash  steps  may
improve assay precision.
6.  Substrate Solution should  remain colorless or  light blue until
added  to  the  plate. Keep Substrate Solution  protected  from
light. Substrate Solution should change from colorless or light
blue to gradations of blue.
7.  Stop Solution should be added to the plate in the same order
as  the Substrate Solution. The  color developed  in  the wells
will turn from blue to yellow upon addition of the Stop Solution.
Wells  that are green  in color  indicate  that  the Stop Solution
has not mixed thoroughly with the Substrate Solution.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material. 
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OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader capable of measuring absorbance at 450
nm, with the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate
washer.
  An incubator which can provide stable incubation conditions
up to 37°C±0.5°C.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use  a  serum  separator  tube  （SST）  and  allow
samples  to  clot  for  30 minutes  before  centrifugation  for  15
minutes at 1000 g. Remove serum and assay immediay or
aliquot  and  store  samples  at  -20°C. Centrifuge  the  sample
again  after  thawing  before  the  assay.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as
an anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 
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30 minutes  of  collection.  Assay  immediay  or  aliquot  and
store  samples  at  -20°C.  Centrifuge  the  sample  again   after
thawing before the assay. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring  all  reagents  and  samples  to  room  temperature  before  use.  It  is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
All  the  reagents  should  be  added  directly  to  the  liquid  level  in  the well.  The
pipette should avoid contacting the inner wall of the well.
1.  Set a Blank well without any solution. Add 50µl of Standard or
Sample per well. Standard need test in duplicate.  
2.  Add 50µl of HRP-conjugate to each well （not to Blank well）,
then 50µl antibody  to each well. Mix well and  then  incubate
for 1 hour at 37°C.  
3.  Fill  each  well  with Wash  Buffer  （about  250µl）,  stay  for  10
seconds and Spinning. Repeat the process for a total of three
washes. Complete removal of liquid at each step is essential
to  good  performance.  After  the  last  wash,  remove  any
remaining Wash Buffer by aspirating or decanting. Invert the
plate and blot it against clean paper towels. 
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4.  Add 50µl of Substrate A and Substrate B to each well, mix
well. Incubate for 15 minutes at 37°C. Keeping the  plate away
from drafts and other temperature fluctuations in the dark.
5.  Add 50µl of Stop Solution  to each well when  the  first  four
wells  containing  the  highest  concentration  of  standards
develop obvious blue color.  If color change does not appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.  
6.  Determine the optical density of each well within 10 minutes,
using a microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Using  the  professional  soft  "Curve  Exert  1.3"  to  make  a  standard  curve  is
recommended, which can be downloaded from our web.
Average  the  duplicate  readings  for  each  standard,  Blank,  and
sample  and  subtract  the  optical  density  of  Blank.  Create  a
standard  curve  by  reducing  the  data  using  computer  software
capable of generating a  four parameter  logistic  （4-PL） curve-fit.
As  an  alternative,  construct  a  standard  curve  by  plotting  the
mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis  against  the 
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concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the
points on  the graph. The data may be  linearized by plotting  the
log of the cortisol concentrations versus the log of the O.D. and
the best  fit  line can be determined by  regression analysis. This
procedure will  produce  an  adequate  but  less  precise  fit  of  the
data. If samples have been diluted, the concentration read from
the standard curve must be multiplied by the dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the
kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or
sources.
  If samples generate values higher than the highest standard,
dilute the samples with the appropriate Diluent and repeat the
assay.
  Any  variation  in  operator,  pipetting  technique,  washing
technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding. 
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  This  assay  is  designed  to  eliminate  interference  by  soluble
receptors,  binding  proteins,  and  other  factors  present  in
biological samples. Until all  factors have been  tested  in  the
Quantikine  Immunoassay,  the  possibility  of  interference
cannot be excluded.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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大鼠* 大鼠* 大鼠* 大鼠*（Cortisol） （Cortisol） （Cortisol） （Cortisol）ELISA ELISA ELISA ELISA 快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒 快速檢測試劑盒     
使用說明書 使用說明書 使用說明書 使用說明書     
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號：CSB-E05112r
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：0.08 ng/ml -20 ng/ml
zui低檢測限：0.05 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的*，且與其他相關蛋白基本
無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期：6 個月（2-8℃避光保存）
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA法定量測定大鼠血清，血漿中*含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
2.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
采用競爭酶聯免疫法法檢測*含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制
備成固相二抗，然后加入待測標本及辣根過氧化物酶標記的*和抗皮質
醇抗體，使之形成包被二抗-抗*抗體-酶標記*的復合物。經顯色后
在酶標儀測定吸光值（OD值），通過計算機或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反
算出待測標本中*含量。 
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶 酶酶 酶聯 聯聯 聯板 板板 板（Assay plate  ）：                                                                      一塊（96
孔）。  
2.  標準品 標準品 標準品 標準品（Standard）：                                                                        5×0.5ml/
瓶。
 
標準品  S1  S 2  S3  S4  S5
濃度
（ng/ml）
0.08    0.31    1.25  5  20  
 
3.  酶結合物 酶結合物 酶結合物 酶結合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ）：                                                              1×6ml/
瓶。
4.  抗體 抗體 抗體 抗體（ （（ （Antibody） ）） ）：                                                                                1×6ml/
瓶
5.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 A（ （（ （Substrate A） ）） ）：                                                                      1×7ml/
瓶。
6.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 B（ （（ （Substrate B） ）） ）：                                                                      1×7ml/
瓶。
7.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：        1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 20
倍。  
8.  終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                                      1×7ml/
瓶
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標準規格酶標儀 
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2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000  x  g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍
融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8° C
1000 x g 離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復
凍融。
注 注注 注： ：： ：以上標本置 以上標本置 以上標本置 以上標本置 4℃ ℃℃ ℃保存應小于 保存應小于 保存應小于 保存應小于 1 周 周周 周， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃或 或或 或-80℃ ℃℃ ℃均應密封保存 均應密封保存 均應密封保存 均應密封保存， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃不 不不 不
應超過 應超過 應超過 應超過 1 個月 個月 個月 個月， ，， ，-80℃ ℃℃ ℃不 不不 不應超過 應超過 應超過 應超過 2 個月 個月 個月 個月； ；； ；標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此 因此 因此 因此
溶血標本不宜進行此項檢測 溶血標本不宜進行此項檢測 溶血標本不宜進行此項檢測 溶血標本不宜進行此項檢測。 。。 。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
1.  將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時，取濃縮洗滌液，根據當批檢
測數量，用蒸餾水上 1：20 稀釋，混勻后備用。
2.  將酶標板取出，設一個空白對照孔、不加任何液體；每個標準點依次各設
兩孔，每孔加入相應標準品 50ul；其余每個檢測孔直接加待測標本 50ul。   
3.  每孔加入酶結合物 50ul（空白對照孔除外），然后再各加入 50ul 抗體，充
分混勻，貼上不干膠封片，置 37℃溫育 1 小時。
4.  手工洗板，棄去孔內液體。洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復三次
后拍干；洗板機洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。
5.  每孔加顯色劑 A 液 50μl，顯色劑 B 液 50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯
色 15 分鐘，每孔加終止液 50μl。 
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6.  用酶標儀讀數，取波長 450nm，先用空白孔調零點，然后測定各孔 OD值。 
數據處理 數據處理 數據處理 數據處理
1.  手工作圖：用雙對數坐標紙，以標準品濃度為橫軸，以對應的 0D值為縱
軸，畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清 OD值找到對應的濃度
值。
2.  計算機：使用線性擬合功能，應將標準品 S1-S5 的濃度取對數 （Log（濃度））
作為 X，將對應的 OD 值減去空白對照孔 OD 值后取對數（Log（OD 值
-NSB））作為 Y，進行線性擬合。再從擬合線上計算出待測血清濃度。
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項
1.  從冷藏環境中取出的試劑盒內全部瓶裝試劑及所需預包被板條應置室溫
（18-25℃）平衡 30 分鐘后方可使用，余者應及時封好口，放回 2-8℃中避光
保存，以備后用。
2.  使用前試劑應搖勻。
3.  結果判斷須在反應終止后 10 分鐘內完成。
4.  不同批號的試劑不可混用。
5.  加樣時應注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。
6.  操作時，試劑盒內每種試劑各使用一個吸頭，每一種標準品使用一個吸頭，
每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。       
 
 

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