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Rat Testoterone（ （ （ （T） ） ） ）ELISA Kit  
 
Catalog No. CSB-E05100r
（96T）
 
 
 
  This  immunoassay  kit  allows  for  the  in  vitro  quantitative  determination  of  rat
testoterone concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
 
 
CUSABIO BIOTECH CO., LTD.
/    /
: cusabio@    cusabio@ 
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INTRODUCTION
Testosterone  is  a  steroid  hormone  from  the  androgen  group.  In  mammals,
testosterone is primarily secreted in the testes of males and the ovaries of females,
although small amounts are also secreted by the adrenal glands. It is the principal
male sex hormone and an anabolic steroid.  
In both men and women, testosterone plays a key role in health and well-being as
well as in sexual functioning. Examples include enhanced libido, increased energy,
increased  production  of  red  blood  cells  and  protection  against  osteoporosis. On
average,  an  adult  human  male  body  produces  about  forty  to  sixty  times  more
testosterone  than  an  adult  female  body,  but  females  are,  from  a  behavioral
perspective  （rather  than  from  an  anatomical  or  biological  perspective）,  more
sensitive to the hormone. However the overall ranges for male and female are very
wide,  such  that  the  ranges  actually  overlap  at  the  low  end  and  high  end
respectively.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
goat-anti-rabbit antibody. Standards or  samples are  then added  to  the appropriate 
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microtiter plate wells with a HRP-conjugated testoterone and antibody preparation
specific for  testoterone and  incubated. Then substrate solutions are added  to each
well. The  enzyme-substrate  reaction  is  terminated by  the  addition of  a  sulphuric
acid  solution  and  the  color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of testoterone in the samples is
then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
0.1  ng/ml-25.6  ng/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the  ELISA’s
were 25.6 ng/ml, 6.4 ng/ml, 1.6 ng/ml, 0.39 ng/ml, 0.1 ng/ml.
SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural  rat  testoterone.  No  significant
cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of rat testoterone is typically less than 0.06 ng/ml.
The  sensitivity of  this assay, or Lower Limit of Detection  （LLD） was defined as
the lowest protein concentration that could be differentiated from zero. 
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MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standards （S1-S5）  5 x 0.5 ml  
HRP-conjugate  1 x 6 ml
Antibody    1 x 6 ml
Wash Buffer      
1 x 15 ml
  （20×concentrate）
Substrate A  1 x 7 ml
Substrate B  1 x 7 ml
Stop Solution      1 x7 ml
Standard  Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
Concentration
（ng/ml）
0.1  0.39  1.6  6.4  25.6
STORAGE
1.  Unopened  test kits  should be  stored at 2-8°C upon  receipt and  the microtiter
plate should be kept  in a sealed bag. The  test kit may be used  throughout  the
expiration date of the kit. Refer to the package label for the expiration date.
2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it is
stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less  and  an  optical
density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for use
in absorbance measurement. 
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TECHNICAL HINTS
1.  Bring all reagents and plate to room temperature for at least 30 minutes before
use. Unused wells need store at 2-8℃and avoid sunlight.
2.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,  warm  to  room
temperature and mix gently until the crystals have compley dissolved. Dilute
15 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to prepare
300 ml of Wash Buffer.
3.  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips  between  additions  of  each
standard level, between sample additions, and between reagent additions. Also,
use separate reservoirs for each reagent.
4.  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak  period
following  the  addition  of wash  buffer,  and/or  rotating  the  plate  180  degrees
between wash steps may improve assay precision.
5.  To ensure accurate  results, proper adhesion of plate sealers during  incubation
steps is necessary. Sealers can not be reused.
6.  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.  Keep
Substrate Solution protected from light. Substrate Solution should change from
colorless to gradations of blue. 
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7.  Stop Solution should be added  to  the plate  in  the same order as  the Substrate
Solution. The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon
addition  of  the  Stop  Solution. Wells  that  are  green  in  color  indicate  that  the
Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate Solution.
Precaution: The Stop Solution  provided with  this  kit  is  an  acid  solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader  capable  of  measuring  absorbance  at  450  nm,  with  the
correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a  serum  separator  tube  （SST） and allow  samples  to clot  for 30
minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove serum and
assay  immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°  C.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles. 
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  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an anticoagulant.
Centrifuge  for  15 minutes  at  1000  g within  30 minutes  of  collection. Assay
immediay  or  aliquot  and  store  samples  at  -20°C.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
1.  Set a Blank well without any  solution. Add 50µl of Standard or Sample per
well. Standards need test in duplicate.  
2.  Add 50µl of HRP-conjugate  to each well （not  to Blank well）,  then add 50µl
Antibody to each well. Mix well and then incubate for 1 hour at 37°C.  
3.  Fill  each  well  with Wash  Buffer  （about  200µl）,  stay  for  10  seconds  and
Spinning. Repeat the process for a total of three washes. Complete removal of
liquid  at  each  step  is  essential  to  good  performance.  After  the  last  wash,
remove  any  remaining Wash  Buffer  by  aspirating  or  decanting.  Invert  the
plate and blot it against clean paper towels.
4.  Add 50µl of Substrate A and Substrate B  to each well, mix well.  Incubate
for  15  minutes  at  37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts  and  other
temperature fluctuations in the dark. 
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5.  Add  50µl  of  Stop  Solution  to  each  well.  If  color  change  does  not  appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
6.  Determine  the  optical  density  of  each  well  within  10  minutes,  using  a
microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS
Average  the duplicate readings for each standard, Blank, and sample and subtract
the optical density of Blank. Create  a  standard  curve by  reducing  the data using
computer software capable of generating a four parameter logistic （4-PL） curve-fit.
As an alternative, construct a standard curve by plotting  the mean absorbance for
each standard on the y-axis against the concentration on the x-axis and draw a best
fit curve  through  the points on  the graph. The data may be  linearized by plotting
the log of the testoterone concentrations versus the log of the O.D. and the best fit
line  can  be  determined  by  regression  analysis.  This  procedure  will  produce  an
adequate  but  less  precise  fit  of  the  data.  If  samples  have  been  diluted,  the
concentration  read  from  the  standard  curve  must  be  multiplied  by  the  dilution
factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label. 
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  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.
  It  is  important  that  the Calibrator Diluent  selected  for  the  standard  curve be
consistent with the samples being assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples
with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,  washing
technique,  incubation  time or  temperature, and kit age can cause variation  in
binding.
  This assay  is designed  to eliminate  interference by soluble receptors, binding
proteins, and other factors present in biological samples. Until all factors have
been  tested  in  the  Quantikine  Immunoassay,  the  possibility  of  interference
cannot be excluded.
     
     
     
     
     
     
      
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大鼠睪酮 大鼠睪酮 大鼠睪酮 大鼠睪酮（T） （T） （T） （T）酶聯免疫 酶聯免疫 酶聯免疫 酶聯免疫試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒     
使用說明書 使用說明書 使用說明書 使用說明書     
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產品編號 產品編號 產品編號 產品編號：CSB-E05100r
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：0.1 ng /ml -25.6 ng /ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：0.06 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的睪酮，且與其他相關蛋白基本
無交叉反應。
有效期 有效期 有效期 有效期：6 個月（2-8℃避光保存）
預期應用 預期應用 預期應用 預期應用： ：： ：ELISA 法定量測定大鼠血清，血漿及其它相關生物液體中睪酮
含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
2.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實
驗結果造成任何影響。
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
采用酶聯免疫競爭法檢測睪酮含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制備成
固相二抗，然后加入待測標本、辣根過氧化物酶標記睪酮以及抗睪酮抗體，
使之形成包被二抗-抗睪酮抗體- 睪酮（HRP）復合物，標記睪酮的結合量與
標本中的睪酮量成反比。經顯色后在酶標儀測定吸光值（OD 值），通過計算
機或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測標本中睪酮含量。 
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶 酶酶 酶聯 聯聯 聯板 板板 板（Assay plate ）：                                                                   一塊 （96 孔）。   
2.  標準品 標準品 標準品 標準品 （Standard）：                                                                       5×0.5ml/瓶。 
Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
0.1 ng/ml  0.39 ng/ml  1.6 ng/ml  6.4 ng/ml  25.6 ng/ml
3.  酶結合物 酶結合物 酶結合物 酶結合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ）：                                                          1×6ml/瓶。 
4.  抗體 抗體 抗體 抗體（ （（ （Antibody） ）） ）                                                                              1×6ml/瓶。 
5.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 A（ （（ （Substrate A） ）） ）： ：： ：                                                              1×7ml/瓶。 
6.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 B（ （（ （Substrate B） ）） ）： ：： ：                                                              1×7ml/瓶。 
7.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：     1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 20 倍。   
8.  終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                                1×7ml/瓶。 
需要而未提供的試 需要而未提供的試 需要而未提供的試 需要而未提供的試劑和器材 劑和器材 劑和器材 劑和器材
1.  標準規格酶標儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養箱
4.  干凈的試管和 Eppendof管
5.  系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存 標本的采集及保存
1.  血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000  x  g離心 20 分
鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍
融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8° C
1000 x g 離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復
凍融。
注 注注 注： ：： ：以上標 以上標 以上標 以上標本置 本置 本置 本置 4℃ ℃℃ ℃保存應小于 保存應小于 保存應小于 保存應小于 1 周 周周 周， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃或 或或 或-80℃ ℃℃ ℃均應密封保存 均應密封保存 均應密封保存 均應密封保存， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃不應超過 不應超過 不應超過 不應超過 1 個 個個 個
月 月月 月， ，， ，-80℃ ℃℃ ℃不應超過 不應超過 不應超過 不應超過 2 個月 個月 個月 個月； ；； ；標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果 標本溶血會影響zui后檢測結果， ，， ，因此溶血標本不宜進行 因此溶血標本不宜進行 因此溶血標本不宜進行 因此溶血標本不宜進行檢 檢檢 檢
測 測測 測。 。。 。 
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操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
1.  將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時，取濃縮洗滌液，根據當批檢
測數量，用蒸餾水上 1：20 稀釋，混勻后備用。
2.  將酶標板取出，設一個空白對照孔、不加任何液體；每個標準點依次各設
兩孔，每孔加入相應標準品 50ul；其余每個檢測孔直接加待測標本 50ul。   
3.  每孔加入酶結合物 50ul（空白對照孔除外），再按同樣的順序加入抗體
50ul，充分混勻，貼上不干膠封片，置 37℃溫育 1 小時。
4.  手工洗板，棄去孔內液體。洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復三次
后拍干；洗板機洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。
5.  每孔加顯色劑 A 液 50μl，顯色劑 B 液 50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯
色 15 分鐘，每孔加終止液 50μl。
6.  用酶標儀讀數，取波長 450nm，先用空白孔調零點，然后測定各孔 OD值。 
數據處理 數據處理 數據處理 數據處理
1.  手工作圖：用雙對數坐標紙，以標準品濃度為橫軸，以對應的 0D值為縱
軸，畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清 OD值找到對應的濃度
值。
2.  計算機：使用線性擬合功能，應將標準品 S1-S5 的濃度取對數 （Log（濃度））
作為 X，將對應的 OD 值減去空白對照孔 OD 值后取對數（Log（OD 值
-NSB））作為 Y，進行線性擬合。再從擬合線上計算出待測血清濃度。
注意事項 注意事項 注意事項 注意事項
1.  從冷藏環境中取出的試劑盒內全部瓶裝試劑及所需預包被板條應置室溫
（18-25℃）平衡 30 分鐘后方可使用，余者應及時封好口，放回 2-8℃中避光
保存，以備后用。
2.  使用前試劑應搖勻。
3.  結果判斷須在反應終止后 10 分鐘內完成。
4.  不同批號的試劑不可混用。
5.  加樣時應注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。
6.  操作時，試劑盒內每種試劑各使用一個吸頭，每一種標準品使用一個吸頭，
每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。        
 

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