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人 人人 人Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ型膠原 型膠原 型膠原 型膠原（Col Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ）酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào)： ：： ：CSB-E04803h
檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍： ：： ：3.12 ng/ml - 200 ng/ml
zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限： ：： ：0.78 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的人 Col Ⅳ，且與其他相關(guān)蛋白
無(wú)交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ： ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中 Col Ⅳ
含量。
說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明  
1.  試劑盒保存：未開(kāi)封的試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存于 2-8℃；開(kāi)封后的酶標(biāo)板應(yīng)與干燥
劑一起儲(chǔ)存于鋁箔袋中置于 2-8℃保存。僅在此出儲(chǔ)存條件下，產(chǎn)品在有
效期內(nèi)可正常使用。
2.  濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。
4.  剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)
驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。   2
實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 Col Ⅳ抗體的微孔
中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗 Col Ⅳ抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，
經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，
并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Col Ⅳ呈正相關(guān)。
用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。  
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液 *標(biāo)記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）     1×10ml/瓶。 
6.  *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 *標(biāo)記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120µl/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120µl/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                            1×10ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機(jī)
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等   3
標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存  
1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，
取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但
應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2  -  8°C
1000 g離心 15 分鐘，取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于
-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后
檢測(cè)。
3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心 20 分鐘，取上清即可立即
檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。
注 注注 注： ：： ：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果， ，， ，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 。。 。
標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋原則 原則 原則 原則： ：： ：
首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)
做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒
/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 200 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋 200 ng/ml,
100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml，樣品稀
釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0  ng/ml，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制，用完丟棄，下次檢
測(cè)使用新鮮配置的標(biāo)準(zhǔn)品。
如配制 100  ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）200  ng/ml的上述標(biāo)
準(zhǔn)品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類(lèi)推。   4
*標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則 *標(biāo)記抗體的稀釋原則： ：： ：
打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以*標(biāo)記抗體稀釋液稀
釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔 100µl），實(shí)際
配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如 10µl*標(biāo)記抗體加 990µl*標(biāo)記抗體
稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： ：： ：
打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和
素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔
100µl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如10µl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素
加 990µl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時(shí)內(nèi)配制。
操作步 操作步 操作步 操作步驟 驟驟 驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻
時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品
稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。加樣時(shí)，槍頭應(yīng)直接對(duì)
準(zhǔn)液面，切勿沿孔壁加樣。
1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100µl，
余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100µl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，
37℃反應(yīng) 120 分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。   5
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標(biāo)記抗體工作液  100µl （取 1µl
*標(biāo)記抗體加 99µl *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同*標(biāo)記抗體工作液）
100µl，37℃，60 分鐘。
5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90µl，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)
準(zhǔn)品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加
入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底
物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.  用酶聯(lián)儀在 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注
1.  用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào) OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上
蓋或覆膜。   6
4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于 2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體
工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)
勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物
酶標(biāo)記親和素工作液。
5.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上
鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。
計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算
請(qǐng)從我們的下載專(zhuān)業(yè)軟件"Curve Exert 1.3"，并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)
數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；
再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實(shí)際濃度。
注意 注意 注意 注意事項(xiàng) 事項(xiàng) 事項(xiàng) 事項(xiàng)
1.  本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒， ，， ，  48T 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板、 、、 、標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品、 、、 、* * * *
標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半。 。。 。
2.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。   7
3.  洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
4.  一次加樣時(shí)間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 
5.  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做復(fù)孔。
6.  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋
倍數(shù)。
7.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 
8.  底物請(qǐng)避光保存。
9.  不要用其它生產(chǎn)廠(chǎng)家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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