實驗室經驗總結：細胞培養的污染源有這幾個，你造嗎？

上海子實生物（細胞之家）

廣義上來說，凡是細胞培養體系中的外來成分或成分變化，都應視為污染，細胞污染不能*被消除，但能減少其發生的頻率和后果的嚴重性。細胞污染根據污染源主要可以分為物理性，化學性和生物性污染。

（1）物理性污染：

物理性污染通過影響細胞培養體系中的生化成分，從而影響細胞的代謝，如溫 度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產生影響。常見的例子有：培養箱溫度過高、周圍放置能引起機械振動的設備、試劑放在有玻璃門的冰箱中長期受到光照等。物理性污染常常被人們所忽視或被籠統地歸為化學性污染。

（2）化學性污染：

培養環境中許多化學物質都可以引起細胞的污染。化學物質并不總是抑制細胞的生長，某些化學物質如激素就可促進細胞的生長。未純化的物質、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學性污染的來源。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內毒素等物質對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質的超純水。細胞培養使用的所有物質都應是高純度的，并經過機構的鑒定，實驗者本人也應對上述成分進行純度鑒定。同時，正確配置和儲存培養液及試劑也是非常重要的，應該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤，混用類似化合物等錯誤。

（3）微生物污染：

微生物污染的原因可分為2個階段：實驗準備階段和實驗操作過程。準備階段的原因包括：實驗耗材滅菌不*；細胞房清潔度不夠，增加微生物污染風險；超凈臺潔凈度不夠，消毒不夠*，紫外線沒有預先照射足夠時間，表面沒有用酒精擦拭；沒有帶無菌乳膠手套；試劑本身已經污染，沒有檢測出來。實驗操作中的污染，往往是不夠嚴謹，粗心大意造成，如：手從無菌試劑的上方經過；移液器操作不當，液體接觸到移液器前端；移液管吸液過猛；槍頭沒有更換，較差污染等。

不同的微生物污染物對細胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對細胞形態和技能的影響是長期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細菌增殖迅速，能在很短的時間內抑制細胞生長或產生有毒物質殺滅細胞。

   1、霉菌污染：種類很多，污染的多是曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。霉菌污染后多數在培養液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不變混濁。倒置顯微鏡下可以看見細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細胞上及細胞周邊生長。處理：確認是霉菌污染，如果細胞種類不是特別的珍貴，直接放棄，并將實驗環節*消毒。萬不得已，可以嘗試抗霉菌素如*來清楚污染，實際操作中效果很難保證。

 2、細菌污染：細菌污染較常見的有大腸桿菌，白色葡萄球菌，假單孢菌等。加用抗菌素的培養液可預防和排除個別一般少量細菌的污染。一旦發生細菌污染很容易發現，多數情況下培養液短時間內變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯渾濁現象；有時靜置的培養液起初不混，但稍加震蕩，就有許多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以明確細菌種類；有的培養液改變不明顯而有疑似污染，亦可向肉湯培養基內地入少量培養液，37度培養以檢測。處理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作沖擊療法，用藥24~48小時后再換常規培養液，有時在早期污染時此法有效。

3、支原體污染：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(zui小直徑0．2um)并獨立生活的微生物．約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性．可為圓形、絲狀或梨形。

支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7．6—8．0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。支原體污染細胞后．培養液可不發生混濁．多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢．甚至從培養器皿脫落。為確定有無支原體污染可做熒光染色法：用能與DNA特異性結合的熒光染料，可使支原體內含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。處理：市場上有多種支原體清除的試劑盒，效果比較好。

（4）細胞交叉污染

    細胞污染和細菌污染不同，細胞污染是由于在培養過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。這種污染沒有微生物存在，但使培養細胞不同種類之間發生混亂，細胞生長特性，形態發生變化。污染過的細胞由于種類不純，無法進行實驗研究。

    防治及處理：在進行多個種類細胞培養操作時，所有器具要嚴格區分，對每一種細胞按順序進行操作，避免一起操作時造成的混亂；進行換液或傳代操作時，滴管或槍頭要及時更換，避免把細胞帶到培養液瓶中；所有從別處轉來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發現原有的細胞遺傳物發生改變，可以復蘇早期凍存的細胞使用。

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