細(xì)胞培養(yǎng)的一些問題

時間：2017-7-12閱讀：383

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1. 液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好？

要冷藏！！因為液體培養(yǎng)基經(jīng)冷凍后再經(jīng)溶化時，其溶液的pH值會發(fā)生改變，溶液往往變堿，某些成分溶解也會受到影響對細(xì)胞生長不利。故液體培養(yǎng)基一定要存放在冷藏箱中，通常液體培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個月 ~ 一年。

2. 液體培養(yǎng)基中*的作用，及使用方法。

幾乎所有的細(xì)胞對*有較高的要求，細(xì)胞需要*合成蛋白質(zhì)，在缺少*時，細(xì)胞生長不良而死亡。所以，各種培養(yǎng)液中都含有較大量的*。*在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置-20 ?C冰凍保存，用前加入培養(yǎng)基中。加有*的液體培養(yǎng)基4 ?C 冰箱儲存兩周以上時，應(yīng)重新加入原來量的*。基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心在其服務(wù)項目中配制分裝了高濃度（100倍）的*溶液（1ml/支）。每支1ml的*加到99ml*培養(yǎng)基中，其終濃度為2mM/ml培養(yǎng)基。包裝為粉紅色，-24?C保存。

3.培養(yǎng)用液pH對細(xì)胞生長的影響

由于，大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2~7.4，偏離此范圍對細(xì)胞將產(chǎn)生有害的影響。各種細(xì)胞對pH的要求也不*相同，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對pH變動耐受差，無限細(xì)胞系耐受力強。

但總體來說，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強一些，偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。因此，我們在配制培養(yǎng)用液時，可把液體的pH稍微調(diào)得偏酸一些。液體在經(jīng)過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。

4.常用培養(yǎng)基及培養(yǎng)用液的滲透壓范圍

培養(yǎng)基名稱滲透壓范圍（mOSM）

DMEM（高糖） 315 ~ 350

DMEM（低糖） 270 ~ 330

RPMI-1640 260 ~ 290

MEM-EBSS 280 ~ 310

MEM-NEAA 280 ~ 310

McCoy 280 ~ 310

MEM-a 280 ~ 310

M—199 275 ~ 305

IMDM 270 ~ 300

DMEM/F-12 280 ~ 310

F—10 270 ~ 300

F—12 275 ~ 300

培養(yǎng)基名稱滲透壓范圍（mOSM）

L—15 280 ~ 320

D-Hanks 280 ~ 300

Hanks 280 ~ 300

PBS 275 ~ 300

5.細(xì)胞傳代消化時所用*濃度越高越好嗎？

不見得！因為*溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、*濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān)。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液濃度為：

（1）０.０５％*＋０.０２％ＥＤＴＡ；

（2）０.２５％*＋０.０３％ＥＤＴＡ。

（3）0.25% *

溶液ｐＨ８.０～９.０；使用Ｄ－Ｈａｎｋ液配制。

多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用０.０５％*＋０.０２％ＥＤＴＡ這種消化液。

6.培養(yǎng)基在使用過程中應(yīng)注意的問題：

（1）. 培養(yǎng)基在使用前需37 oC預(yù)熱或在室溫平衡后再使用。

（2）. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，吸取過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，防止殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)基焦化，將有害物質(zhì)帶入培養(yǎng)液中。

（3）. 盡量縮短各種液體、細(xì)胞的暴露時間。

（4）. 避免液體間、細(xì)胞間的交叉污染。

（5）.配制*培養(yǎng)基時，配制的量在2周內(nèi)用完為好。

7.血清的有關(guān)問題：

新生牛血清：新出生牛5天內(nèi)取血制成

小牛血清：小牛出生16周以內(nèi)采血制成。

胎牛血清：（進(jìn)口血清）要求剖腹取胎制成。

國內(nèi)廠家往往不能做到，經(jīng)常把出生2天以內(nèi)采血稱為胎牛血清。

根據(jù)血清的生產(chǎn)工藝及血紅蛋白、內(nèi)毒素含量又分為：

（1）.特級胎牛血清：40納米過濾，內(nèi)毒素含量≤10EU，

血紅蛋白含量≤10mg/dl。

（2）.優(yōu)等胎牛血清：經(jīng)過3次100納米過濾，

內(nèi)毒素含量≤25EU/ml，

血紅蛋白含量≤25mg/ml。

（3）.標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清：3次100納米過濾，低內(nèi)毒素，

低血紅蛋白含量。

（4）.活性碳/葡聚糖處理血清：激素含量大大降低。

（5）.透析型胎牛血清：次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。

8. 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液：除培養(yǎng)基、血清、*外，其他幾種液體也屬必須，不可省略。

（1）.雙抗：200倍，（1ml/支）其終濃度為*100U/ml；*100ug/ml，-24 oC保存。

（2）.L-*：100倍，（1ml/支），終濃度2mM，-24 oC保存。

（3）.丙酮酸鈉：配制濃度50mM，4ml/支，終濃度為1mM/ml，

-24 oC保存。

（4）.Hepes液：配制濃度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml

*培養(yǎng)基中，終濃度為25mM/ml，常溫保存。

9.支原體污染及檢測：

（1）.支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)中zui常見、不易被查覺，但支原體污染可顯著影響細(xì)胞功能干擾實驗結(jié)果。支原體是介于細(xì)菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的zui小微生物，它無細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，zui小直徑0.2um，可通過濾器。

目前中心通過對國內(nèi)100余株/系細(xì)胞的檢測，形勢不容樂觀。污染率達(dá)30% ~ 60% 。課題組從國外引進(jìn)細(xì)胞株/系也經(jīng)常出現(xiàn)支原體的污染。支原體在污染細(xì)胞后，它通過影響細(xì)胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培養(yǎng)基中的氨基酸來抑制細(xì)胞的生長，并能降低細(xì)胞的融合率。因此，在運用各種細(xì)胞系進(jìn)行實驗研究時，首先要證明所用細(xì)胞有無支原體的污染。

（2）.支原體污染后，培養(yǎng)基可不發(fā)生渾濁，細(xì)胞病變輕微或不明顯，因此難以發(fā)現(xiàn)。目前，支原體檢測的方法有以下幾種。

（a）.相差顯微鏡觀察；（b）.低張?zhí)幚淼匾录t染色法；

（c）.熒光染色法；（d）.酶標(biāo)法；

（e）.PCR法：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心使用該方法進(jìn)行檢測。

優(yōu)點：靈敏度高，檢測耗時短，樣品量小

（只需50ul細(xì)胞培養(yǎng)用液上清）。

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