小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被活性氧簇（ROS）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的活性氧簇（ROS）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

.血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞

刺激，收集血液后，3000轉離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地

分離。

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液：3000轉離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心0分鐘

取上清。

5.保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于

-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

.酶標儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-0uL、2-20uL、20-200uL、200-000uL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的

濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶*溶解

后再使用。

2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍，zui終結果乘以5才是樣本實際濃度。

4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標板2孔×8條2孔×4條無

標準品0.3mL*6管0.3mL*6管無

樣本稀釋液6mL3mL無

檢測抗體-HRP0mL5mL無

20×洗滌緩沖液25mL5mL按說明書進行稀釋

底物A6mL3mL無

底物B6mL3mL無

終止液6mL3mL無

封板膜2張2張無

說明書份份無

自封袋個個無

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、30、60、20、240、480U/ml

小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒試劑的準備

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按：20稀釋，即份的20×洗滌緩

沖液加9份的蒸餾水。

洗板方法

.手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置min后甩盡

孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5次。

操作步驟

.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封

袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔先加待測樣本0μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不

加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶

（HRP）標記的檢測抗體00μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴

鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去

洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。7.每孔加入終止液50μL，5min內，在450nm波長處測定各孔的

OD值。

結果判斷

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應

OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣

本濃度值。

試劑盒性能

.準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于

0.9900。

2.靈敏度：zui低檢測濃度小于.0U/ml。

3.特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.重復性：板內、板間變異系數均小于5%。

5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.小鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒有效期：6個月