BAC提取前準備（前兩天 ）

    配制含25 mg/l Kan的LB培養基選擇平板，在超凈工作臺上用接種環從購買的BAC劃線接種至選擇平板，于37℃培養箱培養過夜，供選擇單。ELISA試劑盒

BAC提取前準備（前一天）

、在超凈工作臺上，用50 µg/ml Kan和液體LB培養基配制成25 mg/l Kan培養基，每個Falcon試管分裝0 ml。也可先分裝0 ml無抗生素的液體LB培養基后，然后每管中加5 µl濃度為50 µg/ml Kan溶液。

2、在培養皿中標出三個單克隆 （不要太大，不要太小），用牙簽挑取第個單克隆 一半，在的的小培養皿固體LB培養基（分裝0 ml，含25 mg/l Kan）上劃一橫線，標上序號；接著用同一根牙簽挑取第個單克隆的另一半接種到剛配制好的液體培養基中。第2、3個單分別用牙簽挑取在同一個小培養皿固體LB培養基上劃一橫線，分別標上序號。

3、接種的固體培養基置于37℃培養箱過夜。接種到Falcon試管中的E.coli 進行液體振蕩培養（37℃，240 rpm）20小時。

BAC提取（第二天）

    將緩沖液P按要求加入RNase A，置于冰上。緩沖液P3也置于冰上。取出適量緩沖液QF在65℃條件下預熱。其他緩沖液在常溫下保存。

、接種的固體培養基從37℃培養箱中取出，用包裝膜封好后置于4℃條件下貯存。取液體振蕩培養的Falcon試管到超凈工作臺中，在微量離心管中分裝300 µl的E.coli 和300 µl 30%glycerol的LB培養基，用移液器上下吹吸混勻，置于-80℃貯存。

2、將Falcon試管在室溫條件下2700 rpm離心20 min。丟棄上清，將沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml緩沖液P中重懸細菌沉沉小球。邊吹吸邊攪動，混勻而不要出塊菌塊，然后全部轉移到2 ml 微量離心管中。ELISA試劑盒

4、加入0.6 ml緩沖液P2，上下倒置數次，輕輕混和，在室溫下培養5 min。

5、加入0.6ml冰冷的緩沖液P3，立即上下倒置數次，輕輕混和，在冰上培養5 min。

6、用微量離心器在zui大速度下（3000 rpm）離心0 min。此時可支起過濾架，標好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用 ml緩沖液QBT對QIAGEN-tip 20尖管進行平衡處理，讓其在重力作用下從柱中流出。

8、將離心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管，讓其在重力作用下進入樹脂。

9、用4 ml緩沖液QC對QIAGEN-tip 20尖管進行清洗2次，每次用2 ml。

0、清洗后將.5 ml或2 ml微量離心管置于QIAGEN-tip 20尖管頭下，用0.8 ml預熱的緩沖液QF分兩次稀釋DNA 。每次0.4 ml。

、用0.7體積（每0.8 ml稀釋體積用0.56 ml）的isopeopanol在室溫下沉淀DNA 。立即用微量離心機中在3000 rpm 轉速下離心30 min。此步以后在離心機上操作要注意離心管的放置方向，保持沉淀方向一致或作好標記。以利于用移液管移吸上清，不會攪動沉淀。另外，抽吸剩下少量（約 50 ml）溶液可再離心一次，之后全部吸出上清。

2、用 ml 70%酒精加入微量離心管中（洗滌DNA ），在3000 rpm 轉速下離心5 min。先用移液器從沉淀小球對面移去大部分酒精，抽吸剩下少量（約50 ml）溶液再置于3000 rpm 轉速下離心5 min。然后移出酒精，在通風處或超凈工作臺送風條件下風干，但不宜過干，過干很很難溶解。

3、用20 µl TE緩沖液（pH 8）溶解DNA ，置于冰上，每0 min 彈擊微量離心管，以促進DNA 溶解。之于置于4℃條件下過夜。ELISA試劑盒

4、第三天可將DNA 取出，在60℃條件下預熱一小時，每0 min 彈擊微量離心管，以促進DNA 溶解。之后在%的瓊脂糖膠上鑒定。