1、 鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-913 
鮑膿皰病是由河流弧菌Ⅱ型引起，主要發(fā)生在貝類水產(chǎn)動物上。感染的病鮑表現(xiàn)出行動遲緩，
攝食量減少，腹足出現(xiàn)白色膿皰等癥狀并影響其附著力。該病在夏季高溫時(shí)極易爆發(fā)，危害較大。
為了適應(yīng)鮑膿皰病快速檢測和疫病研究的需要，本公司總結(jié)相關(guān)研究報(bào)道并在其基礎(chǔ)上優(yōu)化改
進(jìn)，開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、
應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑，具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
組成成分 體積
樣品 DNA 提取液 1
樣品 DNA 提取液 2
5ml×1 管
500µl×1 管
核酸擴(kuò)增試劑： DEPC 水
鮑膿皰病熒光 PCR 反應(yīng)液
Taq 酶(5U/ul)
陰性對照
鮑膿皰病熒光陽性對照
5ml×1 管
750µl×1 管
40µl×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。 
3、樣本采集，存放及運(yùn)輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取組織標(biāo)記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA 抽提試劑操作說明提取DNA模板。
3.2存放：研磨后的樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應(yīng)不超過24 h；-70 ℃以下可保存，但應(yīng)避免
反復(fù)凍融（zui多凍融3次）。
3.3 運(yùn)輸：采用泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。 
4、檢測步驟 
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)： 
4.1.1 取 n 個(gè) 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個(gè)管進(jìn)行
編號標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)
4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用
一個(gè)吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。
4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃
條件下，2 000 r/min 離心 10 s。
4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，
即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
4.2 熒光 PCR 檢測 
4.2.1 鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：
從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系
配制見下表 2。
表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表
試劑 熒光 PCR 反應(yīng)液 Taq 酶 合計(jì)
用量 14.5 μL 0.5μL 15μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：
向每個(gè)熒光 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：
循環(huán)條件設(shè)置：
*階段，95℃/5 sec；
第二階段，95℃/10 sec，60℃/20 sec，35 個(gè)循環(huán)；在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和 Ct 值判定結(jié)果。
5、結(jié)果判定 
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴(kuò)增曲線的zui高點(diǎn)為準(zhǔn)。
5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
5.2.1 陰性對照無 Ct 值或無擴(kuò)增曲線。
5.2.2 陽性對照的 Ct 值應(yīng)<25.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
5.3 結(jié)果描述及判定
5.3.1 陰性：無Ct值或無擴(kuò)增曲線，示樣品中無鮑膿皰病核酸。
5.3.2 陽性：Ct值≤30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，示樣品中存在鮑膿皰病核酸。
5.3.3 有效原則：Ct>30的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。
6、鮑膿皰病熒光PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
F：GACGCTTGGCAGTGTTCAAC
R：GTGCATTCCACCATATTTTCTTACG
Probe：5’-FAM-TGTCAGCACGCCAATCAATCACCCG-Eclipse-3’