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探針法熒光定量PCR試劑盒它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據小反芻獸疫病毒高度保守區設計，不會跟其他病毒的RNA發生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。

規格及成分

成分	編號	十孔盒包裝
探針法 qRT-PCR 緩沖液	A	500μL（黃蓋）
探針法 qRT-PCR 酶混合液	B	100μL（紅蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液	C	1 mL（黃蓋）
探針法 qRT-PCR引物混合液	D	100 μL（白蓋）
小反芻獸疫病毒 qRT-PCR 探針	E	50 μL（棕色管）
探針法 qRT-PCR陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	F	50 μL（黃蓋）
核酸釋釋劑（試用裝）	G	20 次（1mL，綠蓋）
使用手冊	H	一份

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

探針法熒光定量PCR試劑盒自備試劑：樣品 RNA。

使用方法

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7. 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。也以選購本公司的柱式病毒RNAout。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為RT-PCR模板，省略了RNA提取步驟。

三、Probe qRT-PCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的 N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4 個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：

成分	樣品管N+2個	RT-PCR陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7 管）
探針法qPCR緩沖液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探針法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
qRT-PCR探針	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
探針qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待測樣品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超純水	--	5 μL	--
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7 號）	--	--	各5 μL（2號樣到2號管，3號樣到3 號管…）

蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 qRT-PCR：

過程	溫度	時間
逆轉錄	50℃	30 min
預變性	94℃	10 min
qRT-PCR 反應（40 個循環）	94℃	15 sec
qRT-PCR 反應（40 個循環）	60℃	1 min（采集 FAM 通道的熒光信號）

五、數據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。

六、常見問題與解決方法:

常見問題	可能原因	解決方法
陽性對照、待測樣本均無條帶。	PCR反應體系或反應條件不合適。	使用梯度PCR摸索PCR反應條件。
	PCR試劑保存不當失去活性。	2× PCR Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。
	引物設計問題。	嘗試重新設計引物進行檢查。
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。	不當儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。	使用新鮮的試劑。
	加入組織裂解液過量。	增大反應體系，或減少裂解液的用量。
	樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已經降解。	裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。
	模板加入量不適合。	在反應體系10-20%范圍內優化模板加入量。反應效性能較差時，可以降模板濃度調節到低于10%的范圍。
	PCR循環數不足。	適當增加PCR的循環數，推薦在35-40循環為佳。因為模板復雜，一般PCR反應要比用純化的 DNA模板多5-10個循環為佳。
非特異性擴增	PCR退火溫度太低，循環數、引物濃度或模板濃度太高。	增加PCR退火溫度，降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。
	PCR引物錯配。	重新設計PCR引物。
	配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。	PCR反應體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應。
陰性對照出現目的條帶	操作工具或試劑污染。	實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。
陰性對照出現目的條帶	樣本間交叉污染。	每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。