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南京信帆生物技術有限公司
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南京信帆生物:miRNA研究如何克服樣本量的限制

時間:2016/5/19閱讀:1165
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一提起miRNA的發現,新一代測序就笑了。RNA-seq這種新技術發現,可鑒定SNP、突變和新的miRNA。RNA-seq通常被視為一種篩查技術。就目前而言,它以一種半定量但極透徹的方式鑒定樣本中的所有序列。當然,它價格不菲,數據分析繁復,并非全部實驗室都有機會使用。

qRT-PCR這種經典技術仍然是miRNA表達譜分析的方法,因為它符合您的所有期望:樣本量低、靈敏度高、特異性好以及動態范圍廣。在單次運行中,從10到107個拷貝的miRNA靶標都能準確定量。一般而言,每次分析需要1 ng總RNA,而miRNome的分析需要1 μg RNA。對于細胞系的分析,這點RNA當然是小菜一碟,但并非所有研究都那么幸運。分選后的細胞、激光捕獲組織、循環腫瘤細胞如此珍貴,未必能實現。在此,我們就介紹一個基于PCR的系統,它能將miRNome分析所需的樣本量降低了幾個數量級,同時帶來了出色的重復性和性。

miRNA的預擴增

這就是來自QIAGEN的miScript® PreAmp Primer Mixes 。盡管市場上也有一些方法能預擴增miRNA,但miScript PCR System是*一種技術,包含了真正通用、小RNA特異的cDNA合成反應。

在這種技術中,miRNA被大腸桿菌poly A聚合酶加尾,接著以oligo dT為引物合成cDNA。這確保了所有miRNA都能無偏向地轉化成cDNA。更重要的是,這包括了過去未曾鑒定的miRNA,讓您在發現了新的miRNA靶標時能隨時返回到原先保存的cDNA樣本。在此,RNA的用量不是很關鍵,但QIAGEN建議cDNA合成反應包含10 ng RNA(相當于300個細胞)。每個cDNA合成反應可用于10次預擴增反應,每次1 μl(相當于1 ng RNA或30個細胞)。更多RNA當然也可以,但沒有必要。更少RNA也并非不行,但若少于3個細胞,取樣的差異會導致中等或低表達miRNA的結果發生變化。

預擴增過程是一個高度多重的PCR,以96或384個分析的形式開展,這對應了QIAGEN預開發的96-和384-分析的miScript miRNA PCR Array。經過12個循環的預擴增,其產物可與實時定量PCR預混液混合,用于miRNA表達譜分析。無論是10-20個拷貝的靶標,還是107個拷貝的靶標,如今都增長了4個數量級。這下,您再也不用擔心樣本量不夠了。FFPE組織,血液、尿液等體液都能采用這種辦法預擴增。

樣本量是夠了,但預擴增會不會影響miRNA表達譜本身呢?相信這是大家zui關心的問題。如此大量分析的同時開展,確實是個難題,但QIAGEN通過一些設計特征使其成為可能。首先,由于miScript PCR System采用通用的3’ PCR引物,預擴增引物庫的復雜度立即下降50%。其次,所有的擴增子都有著相同的大小和非常接近的Tm,這大大有利于多重反應的無偏向擴增。zui后,cDNA合成反應的試劑嚴重限制了cDNA副反應,這樣背景cDNA極少,而預擴增反應中的背景也極低。

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