1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應 根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

    (2) 免疫動物的選擇。根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來 源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免 疫程序能適用于各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內、滴鼻或點眼。zui后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。 在zui后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到zui高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細胞，這在zui后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天后即可融合。

細胞融合

    首先制備細胞培養基、 氨基喋呤（A）貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液等各種細胞生長所需的營養物質。然后制備髓瘤細胞和脾淋巴細胞，之后進行細胞融合。在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這 種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長 條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。

雜交瘤細胞篩選

    雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和 實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報 告結果，以便決定雜交瘤細胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測 方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗
    體檢測方法所需要的“動力學范圍”，即檢出背景以上的zui強與zui弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而 定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白 抗原，檢測系統可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的 影響。結合補體的抗體可以用基于細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結合蛋白A的檢測方法。