1)訓練目的

    掌握動物細胞培養中的無菌操作技術；為后續實驗如細胞傳代培養、細胞純化和冷凍保存等實驗提供材料；掌握細胞原代培養中常用的組織塊培養法和消化培養法的操作要領。

2)實驗材料

①材料：妊娠10一14 d的小鼠。

②試劑：75％乙醇、Hank’s液、DMEM培養液(含10％FBS和抗生素)、1份0．25％*加1份0．02％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)。

③器材：超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2培養箱、離心機、高壓滅菌鍋、電熱干燥箱、酒精坷、分析天平、吸管彎頭和直頭和膠帽、細胞培養瓶、培養皿、燒杯(100 mL)、*、*、鑷子、解剖盤、不銹鋼篩(100目)、離心管(10 mL)、計數板。

3)操作步驟

(1)組織塊培養法

①取材：將妊娠10一14 d的小鼠用引頸處死，然后將其整個浸入盛有75％乙醇的燒杯中5 s，取出后放入已經消毒的腎形解剖盤中，用普通*、*在動物軀干中部環形切開皮膚，并將兩側皮膚分別拉向頭尾把動物反包，暴露軀干。用眼科剪、*切開動物腹肌和腹膜，并取出含有胎兒的兩側子宮放入60 min培養皿中，剖開子宮體，取出胎兒，在Hanks's液體內洗去血液、羊水、胎膜等雜物后放入另一培養皿。

②剪切：去除胎兒頭、尾及內臟，只留下胎兒四肢及軀干部分，在Hank's液內洗2～3次去除血污后，放人60 mm培養皿或*小瓶內，用眼科剪、*反復將小鼠胎兒剪切成1 mm3的小塊。

③接種：用彎頭吸管吸取若干組織小塊，置于培養瓶中；用吸管彎頭把組織小塊接種到培養瓶底上，小塊相互距離5 min為宜，每25 mL培養瓶可接種20～30塊。

④黏附培養：組織塊放置好后，吸凈培養瓶內的培養液，輕輕將培養瓶翻轉，使接種組織塊的瓶底向上。注意翻轉瓶時勿使組織塊流動，蓋好瓶蓋，將培養瓶放置于CO2培養箱內37℃培養2—4 h，使組織塊微干并黏著在培養瓶底上。

⑤培養：從培養箱中取出培養瓶，開蓋，瓶底向上，從瓶底角部加入1 mL*DMEM培養液；然后緩慢 翻轉培養瓶，讓培養液慢慢覆蓋附著于培養瓶底的組織小塊，置培養箱中培養。待細胞從組織塊游出數量較多時，再補加培養液至約3 mL。

    在翻轉培養瓶和加液過程中，嚴禁動作過快產生沖力，使黏附的組織塊漂起而造成原代培養失敗。若組織塊不易貼壁，可預先在瓶壁涂上薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。

    組織塊培養也可以不用翻轉法，即在接種組織塊后，向培養瓶內僅加入少量培養液，能保持組織塊濕潤即可。蓋好瓶蓋，放入培養箱內培養24 h再補加培養液。

(2)消化培養法

①取材與剪切：同組織塊培養法：

②消化：將剪切后的組織小塊移入10 mL離心管內，加入2 mL的O 25％*+0.02％EDTA組成的消化液，室溫下消化15～20 min，期間用吸管吹打數次，并隨時吸取少量消化液在顯微鏡下觀察，如發現組織已分散成細胞團或單個細胞。則立即加入8 mL含5％FBs的Hank’s液終止消化。

③用吸管反復吹打組織塊，分散單細胞，用100目不銹鋼網篩過濾，收取濾出液，2 000 r／min離心5 min，棄上清液。

④用Hank，。液重懸細胞，2 000 r／min離心5 min后棄上清液；重復漂洗兩次，以去除細胞懸液中的細胞碎片等。

⑤用2 mLDMEM+10％FBS培養液懸浮細胞，計數并稀釋細胞濃度至(1～5)×106個／mL，加細胞懸液入培養瓶。置37℃、5％C02培養箱中靜置培養，24 h后，更換新培養液，此后每3 d換液1次。

4)注意事項

①消化培養法效率較高，可得到大量的原代細胞用于培養，但操作步驟較多，操作時要特別注意，以防微生物污染而導致培養失敗。

②對于不同的組織需用不同的消化方法，一般而言，胚胎類軟組織用*或EDTA即可得到理想的消化效果，而對于成體組織由于存在大量的細胞外基質，需用膠原酶，有時配合使用半透明質酸酶會加速消化過程。

③在組織消化過程中要隨時取樣進行觀察，發現組織已分散成細胞團或單個細胞時應立即終止消化，以免消化過度影響細胞的貼壁生長。

④細胞接種濃度不宜過大，否則會影響貼壁和細胞生長。