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將待測蛋白配成合適濃度
另取3支清潔試管,編號8、9、10,用微量注射器按表6-2操作,將待測蛋白配成系列濃度。
待測蛋白的稀釋
管號 | 待測蛋白質(mL) | 緩沖液(mL) | 總體積(mL) | 稀釋倍數 |
8 | 20 | 80 | 100 | 5 |
9 | 40 | 60 | 100 | 2.5 |
10 | 60 | 40 | 100 | 1.67 |
加入G250試劑
各試管充分混勻后,用取樣器分別加入5.0mL考馬斯亮蘭G250試劑,每加完一管,立即混合(注意不要太劇烈,以免產生大量氣泡而難于消除)。
比色
各管室溫靜置2~5min后,在分光光度計上測定595nm處的光吸收值A 595 ,空白對照為第1號試管,標準和待測蛋白樣同時比色。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),只能使用玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇潤洗,洗去顏色。
制作標準曲線
以標準蛋白質濃度(mg/mL)為橫座標、吸光度值A 595 為縱座標作圖,即得到一條標準曲線。
根據標準曲線計算待測蛋白濃度
在標準曲線上,根據測出的待測樣品的A 595 值,查出試管中蛋白質濃度,再按照計算公式:
待測蛋白質的濃度(mg/mL)=查出的濃度×稀釋倍數 |
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