以常用的間接法測抗體和夾心法測抗原為例。陽性標本中含有檢測系統中特異的抗體或抗原，作為橋梁聯結免疫吸附劑和酶結合物，使酶結合物吸附在固相上，無色底物在酶的作用下轉變成有色產物，這就是陰性的顯色，顯色的深度與陽性標本中待測抗體或抗原的量成正比。陰性標本中不含待測的抗體或抗原，酶結合物不能聯結在固相上，故不顯色。但ELISA是一個復雜的、多步驟的反應過程，反應各步中酶結合物都有可能非特異性的吸附在固相載體上，與底物反應呈現顏色，這就形成了陰性的本底。酶結合物在固相上的非特異吸附通常有以下幾條途徑。

    酶結合物直接吸附在固相載體上。酶結合物是蛋白質，可以直接吸附在固相載體表面。但在ELISA這一步驟中選擇了不利于這種吸附的條件，一般說來只要酶結合物工作濃度適當和反應后經過*洗滌，可以避免這種吸附。

    酶結合物與固相上包被蛋白質成分起反應。包被抗原不純時，雜質蛋白也會吸附在固相載體上，某些雜質可與酶標抗體因“錯認"而結合。

    在間接法中，雜抗原還有可能與血清標本中的免疫球蛋白特異或非特異地結合。另外非特異的免疫球蛋白也可吸附在包被的特異抗原上，特別是這種抗原為堿性蛋白質時，此時酶標記的第二抗體就與吸附的免疫球蛋白反應而形成陰性本底。

    在間接法中標本中的非特異免疫球蛋白的含量遠遠超過特異性抗體，因此可以直接吸附在固相上，這是形成陰性本底的主要原因。聚苯乙烯對免疫球蛋白有很好的吸附性能，IgM的吸附力大于IgG，聚合IgG的吸附力大于單體的IgG。酶標記的抗Ig（二抗）對吸附在載體上的Ig和與固相抗原結合的特異性Ig有著同樣的親和力，因此在加入標本的反應中，雖然采取了不利于吸附的條件，但假設血清標本不作適量的稀釋，高濃度的Ig中仍有一些能吸附在固相上，因而產生較高的本底。

    在雙抗體夾心法中，標本中如含有類風濕因子，也能使陰性血清顯色。類風濕因子是作用于多種動物IgG Fc段的自身抗體，多為IgM類，是一種多價抗體。在夾心法檢測中充當抗原成分，同時在固相抗體及酶標抗體反應，使酶標抗體結合到載體上。

    在ELISA中引入*－親和素系統可以提高檢測的靈敏度，但如果使用不當，可使本底加深，反而得不償失。*標記蛋白質如比例不合適，極易形成較高的陰性本底。從蛋清中提取的親和素是一種堿性糖蛋白，可以通過靜電作用吸附在聚苯乙烯上，也是造成BA-ELISA高本底的因素之一。從鏈球菌中提取的親和素改善了這一非特異吸附現象。