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我們將噬菌體展示技術和蛋白酶解(proteolysis)相結合,從蛋白質—噬菌體混合物和文庫中篩選出穩定折疊的變異體。該方法的前提是不穩定的和(或)部分折疊的蛋白質應該比穩定折疊的蛋白質對蛋白酶的酶切更加敏感,將這與噬菌體展示技術相結合來實現如后所述的篩選。目標蛋白在N端用*標簽標記,然后在C端與噬菌體少數衣殼蛋白pⅢ融合后在噬菌粒載體中被表達出來,形成單價展示。
我們實驗室開發的蛋白酶篩選方法的原理:
展示了蛋白質的噬菌體通過N端的*標簽與鎳基質結合(步驟1);
用蛋白酶處理結合后的噬菌體,展示了對蛋白酶作用敏感的蛋白質的噬菌體被從基質上切除,并被洗滌下來(步驟2);
然后從鎳基質上將展示了蛋白質的、能抵抗蛋白酶作用并因此保持與基質結合的噬菌體洗脫下來(步驟3);
將這些噬菌體擴增,以供進一步的篩選或DNA序列測定(步驟4) 用噬菌體展示進行蛋白酶篩選的兩種方法的對比:
(a)我們實驗室開發的基于親和性的方法;
(b)Plackthun/Schmid小組和Winter小組描述的將蛋白質的酶解和噬菌體的感染力相結合的方法
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