支原體污染檢測試劑盒(PCR法)
(PCR Mycoplasma Detection Kit)
Cat number：YS012
Store at -20℃ for one year
Expire date：
For Research Use Only
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支原體污染檢測試劑盒(PCR法)一、試劑盒說明
本試劑盒通過PCR 法對細胞培養物、動物分泌物等多種生物材料進行支原體污染檢測。常
規培養法進行支原體檢測一般需要幾天的時間，而本試劑盒通過PCR 擴增及電泳分析進行
支原體檢測只需幾個小時，方便快捷。本試劑盒的多對引物能特異性擴增多種支原體rRNA
基因片段，一次就可以檢測至少11 種的支原體，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，
M. orale ， M. salivarium ， M. hominis ， M. pulmonis ， M. arthritidis, M. neurolyticum, M.
hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA 堿基序列非常保守，而rRNA
操縱子上編碼rRNA 的DNA 間隔區如16S 和23S 間隔區，各種生物種間的堿基序列差別很
大。這個間隔區的DNA 序列及長度在支原體各個種間既有相對保守的部分，也有具有很大
差異的部分。因此可以在編碼16S 和23S rRNA 的DNA 上設計一對引物，擴增編碼16S 和
23S rRNA 的DNA 間隔區，然后在編碼16S 和23S rRNA 的DNA 間隔區的保守區上設計一
條引物，在編碼23S rRNA 的DNA 上設計一條引物進行嵌套式PCR。能特異性檢測出支原
體DNA，檢測靈敏度與特異性都很高。
支原體污染檢測試劑盒(PCR法)二、試劑盒組份
組份YS012(20 assays) 儲存條件
10×Taq Buffer(不含Mg2＋) 1.0 mL -20℃
MgCl2(25mM) 1.0 mL -20℃
Taq DNA Polymerase(5 U /μl) 100 U -20℃
Myc F1 Primer (10μM) 50μL -20℃
Myc R1 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc F2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Myc R2 Primer(10μM) 50μL -20℃
Control Template(1 ng/μl) 50μL -20℃
DNA 溶解液2 mL -20℃
ddH2O 5 mL -20℃
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
離心機、微量移液器、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs(10mM)、瓊脂糖、溴化乙錠
等
四、使用注意事項
整個實驗，應規范操作，反應體系的配制、樣本處理及加樣、PCR 擴增應分區域進行，以
避免交叉污染。
支原體污染檢測試劑盒(PCR法)五、操作方法
1.收取待檢樣品(細胞一般生長至80％左右即可，貼壁細胞不宜用消化液消化細胞，可以使
用細胞刮刮取細胞)，然后取細胞懸液200ul(約1～3×105 細胞數)至離心管，12000rpm 離心
5～10min；去上清，加入50ul DNA 溶解液，充分懸浮沉淀物，沸水浴5min；樣品使用前
12000rpm 離心5～10min，取上清4ul 作為PCR 反應模板；剩余樣品可以-20℃保藏。樣本
有時也可以直接用污染液直接做PCR 反應。
2.PCR 反應
*步PCR：
50μL 體系PCR 反應(如客戶需要使用更小量的反應體系，試劑加樣量按比例進行減少)：
(1)．使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm 離心20s；
(2)．取滅過菌的0.2mL 離心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F1 (10μM) 1 μL
Myc R1 (10μM) 1 μL
DNA 樣品1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．輕輕混勻，2000rpm 離心20s；
(4)．進行PCR 擴增
PCR 擴增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL 體系PCR 反應(如客戶需要使用更小量的反應體系，試劑加樣量按比例進行減少)：
(1)．使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm 離心20s；
(2)．取滅過菌的0.2mL 離心管，在冰上依次加入
10×Taq Buffer 5 μL
dNTPs (10mM) 1 μL
MgCl2 (25mM) 4 μL
Myc F2 (10μM) 1 μL
Myc R2 (10μM) 1 μL
*步產物1~5 μL
Taq DNA Polymerase 0.5 μL
ddH2O up to 50 μL
(3)．輕輕混勻，2000rpm 離心20s；
(4)．進行PCR 擴增
PCR 擴增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
3.反應結束后，取反應液10μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR 反應產物。如果此PCR 產
物需用于以后實驗，應將PCR 產物冷凍保存。
4.根據感染支原體類型的不同，擴增產物大小有所不同，*步PCR 產物在350～700bp 之
間，第二步PCR 產物在150～250bp 之間。支原體污染檢測試劑盒(PCR法)
