實驗方法原理
本實驗以酵母RNA 為材料, 將RNA 用堿水解成單核苷酸,再用離子交換柱層析進行分離, zui后采用紫外吸收法進行鑒定。同時通過測定各單核苷酸的含量, 可以計算出酵母RNA 的堿基組成。
實驗材料 酵母RNA
試劑、試劑盒 陰離子交換樹脂聚苯乙烯-二乙烯苯-*胺季銨甲酸甲酸鈉KOH蒸餾水過氯酸NaOHHClAgNO3
儀器、耗材 層析柱梯度洗脫器電磁攪拌器恒流泵自動部分收集器酸度計紫外分光光度計旋渦混合器核酸蛋白檢測儀臺式離心機
實驗步驟
1. RNA 的堿水解
稱取20 mg 酵母RNA, 置于刻度離心試管中, 加2ml 新配 制的0 . 3 mol/ L KOH, 用細玻璃棒攪拌溶解, 于37 ℃ 水浴中保 溫水解20 h。然后用2 mol/ L HClO4 ( 過氯酸) 調水解液pH 至2 以下( 要少量多次, 只需幾滴即可) 。由于核苷酸在過酸的條件 下易脫嘌呤, 所以滴加HClO4 時需用旋渦混合器迅速攪拌, 防 止局部過酸, 再以4000 r/ min 的轉速離心15 min , 置冰浴中 10 min , 以沉淀*。將上清液倒入另一刻度試管中, 用2 mol/ L NaOH 逐滴將上清液pH 值調至8～9 , 作上樣樣品液備用。樣品 液上柱前, 取0 . 1 ml 稀釋500 倍, 測定其在260 nm 波長處的光 吸收值, 用以zui后計算離子交換柱層析的回收率。
2. 離子交換樹脂的預處理
取201×8 粉末型強堿型陰離子交換樹脂8 克(濕) , 先用蒸 餾水浸泡2 h , 浮選除去細小顆粒, 同時用減壓法除去樹脂中存 留的氣泡, 然后用四倍樹脂量的0 . 5 mol/ L NaOH 溶液浸泡1 h , 除去樹脂中的堿溶性雜質。用去離子水洗至近中性后, 再用四倍 量1 mol/ L HCl 浸泡半小時, 以除去樹脂中酸溶性雜質。接著用 蒸餾水洗至中性( 可以上柱洗) , 此時陰離子交換樹脂為氯型。
3. 離子交換層析柱的裝柱方法
離子交換層析柱可使用內徑約1 cm、長10 cm 的層析柱, 柱 下端有燒結上的垂熔濾板, 柱上端使用橡皮塞, 塞子中間打一小 孔。緊緊插入一根細聚乙烯管, 層析柱夾在鐵架臺上, 調成垂 直, 柱下端細膠管用螺旋夾夾緊, 向柱內加入蒸餾水至2/ 3 柱 高, 再用滴管將經過預處理的離子交換樹脂加入柱內, 使樹脂自 由沉降至柱底, 放松螺旋夾, 使蒸餾水緩慢流出, 再繼續加入樹 脂, 使樹脂zui后沉降的高度約為6～7 cm .。注意在裝柱和以后使 用層析柱的過程中, 切勿干柱, 樹脂不能分層, 樹脂面以上要保 持一定高度的液面(不能太高, 約1 cm) , 以防氣泡進入樹脂內 部, 影響分離效果。
4. 樹脂的轉型處理
樹脂的轉型處理就是使樹脂帶上洗脫時所需要的離子。本實 驗需要將陰離子交換樹脂由氯型轉變為甲酸型。先用200 ml 1 mol/ L 甲酸鈉洗柱, 用1% AgNO3 檢查柱流出液, 直至不出現 白色AgCl 沉淀為止。然后改用約200 ml 0 . 2 mol/ L 甲酸繼續洗 柱, 測定流出液的A260 ≤ 0 . 020 為止。zui后用蒸餾水洗柱, 直至 流出液的pH 值接近中性(或與蒸餾水的pH 相同) 。
5. 加入樣品并淋洗除去不被樹脂吸附的組分
加樣就是將RNA 堿水解產物轉移到離子交換層析柱內, 使 其被離子交換樹脂吸附。先將柱內液體用滴管輕輕吸去, 使液面 下降到剛接近樹脂表面。旋緊下端螺旋夾, 用滴管準確移取1 . 0 ml RNA 堿水解樣品液, 沿柱壁小心加到樹脂表面, 然后松開下 端螺旋夾, 使樣品液面下降至樹脂表面, 接著用滴管加入少量蒸 餾水, 當水面降至樹脂表面時, 再用約200 ml 蒸餾水洗柱, 將不 被陰離子交換樹脂吸附的嘌呤及嘧啶堿基、核苷等雜質洗下來。 檢查流出液在260 nm 波長處的吸光度, 直至低于0 . 020 為止。 關恒流泵, 旋緊柱下端螺旋夾。
6. 梯度洗脫
在梯度洗脫器的混合瓶內加入300 ml 蒸餾水, 貯液瓶中加入 300 ml 0 . 20 mol/ L 甲酸-0 . 20 mol/ L 甲酸鈉混合液(注意: 梯度洗 脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水, 趕盡氣泡)。洗脫器出口 與恒流泵入口用細塑料管相連, 打開兩瓶之間的連通閥和出口 閥, 打開電磁攪拌器, 松開柱下端螺旋夾, 開啟恒流泵, 控制 流速為5 ml / 管/ 10 分, 開啟部分收集器, 分管收集流出液。 以蒸餾水為對照, 測定各管在260 nm 波長下的A260 值, 給各管 編號, 并標出zui高峰的收集管。
7. 核苷酸的鑒定
分別測定zui高峰管內液體在230～300 nm 之間, 每相差5 nm 間隔的光吸收值。其中包括有250 nm、260 nm、280 nm, 290 nm 各點( 注意: 液體均要保留, 切勿倒掉。測量時用石英杯)。由 于在小于250 nm 時, 甲酸( HCOOH ) 具有很強的光吸收值, 因此測定時所用參比對照液近似為: *個峰用0 . 05 mol/ L 甲酸-0 . 05 mol/ L 甲酸鈉。 第二個峰用0 . 10 mol/ L 甲酸-0 . 10 mol/ L 甲酸鈉。 第三個峰用0 . 15 mol/ L 甲酸-0 . 15 mol/ L 甲酸鈉。 第四、五兩峰用0 . 20 mol/ L 甲酸或0 . 20 mol/ L 甲酸鈉。 也可以根據zui高峰所在位置, 計算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇 參比液。
8. 測定各種核苷酸的含量和總回收率
分別合并(包括zui高峰管在內) 各組分洗脫峰管內的洗脫 液, 用量筒測出溶液總體積, 然后測定其A260 值, 參比對照液同 上。根據層析柱上樣液的A260 值以及層析后所得到的各組分A260 值之和, 可以計算出離子交換柱層析的回收率( 注: RNA 的摩 爾消光系數E260 為7 . 7×103 ～7 . 8×103 , 水解后增值40%) 。
9. 樹脂的再生
使用過的離子交換樹脂經過再生處理后, 可重復使用。可以 在柱內處理, 也可以將樹脂取出后處理。取出樹脂的方法是用橡 皮球由層析柱的下端向柱內吹氣, 用燒杯收集流出的樹脂。樹脂 再生的方法與未使用的新樹脂預處理方法相同。也可以直接用 1 mol/ L NaCl 溶液浸泡或洗滌, zui后用蒸餾水洗至流出液的pH 值接近中性。
【結果處理】
1. 作出陰離子交換樹脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線, 以 層析流出液管數(或體積) 為橫坐標, 以相應的A260 值為縱坐 標, 作出洗脫曲線圖。
2. 作出各單核苷酸的紫外吸收光譜圖, 根據各組分溶液在 230～300 nm 波長范圍內的吸光值, 以波長( nm) 為橫坐標, 吸 光值為縱坐標, 作出它們的吸收光譜圖。由圖上求出每個單核苷 酸組分的zui大吸收峰的波長值, 同時, 計算出各個組分在不同波 長的吸光值比值( 250/ 260 , 280/ 260 , 290/ 260) , 將它們與各核 苷酸的標準值列表比較, 從而鑒定出各組分為何種核苷酸。
3. 根據層析上樣液的A260 值, 以及層析后所得到的各組分 A260 值之和, 計算出離子交換柱層析的回收率。
