1966年，Nakane等人用酶代替標記抗體，之后Sternbenger等成功引入非標記抗體，使得免疫酶法得到長足的發展，并成為應用zui廣泛的免疫組化技術。下面將介紹免疫酶法的優點以及實驗方法等內容。
免疫酶法是借助酶細胞化學等手段顯示組織抗原(或抗體)的新技術，是在免疫熒光法的基礎上發展起來的。免疫酶法的基本原理與免疫熒光法有所相似，免疫酶法是將酶以共價鍵的形式結合在抗體上，制成酶標抗體，再借助酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面或細胞內部各種抗原成分的定位。已如前述，免疫熒光法具有操作簡便、靈敏、特異性高、省時的優勢，但同時也具有令人遺憾的不足，特別是熒光標本不能*保存以及需要價格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的問題。為此，Nakane等人(1966)嘗試了用酶代替熒光素來標記抗體的方法，從而成功地開創了酶標記抗體的新技術(酶標抗體法)。Sternbenger等人又將非標記抗體過氧化物酶法成功地引人，使免疫酶法有了很大的進步，成為當今使用的免疫組織化學技術。
免疫酶法與免疫熒光法相比較，具有以下優點：酶反應產物呈現的顏色不僅能在一般的普通生物顯微鏡下觀察，而且其產物因具有一定的電子密度也可在電鏡下觀察(免疫電鏡技術)，光鏡與電鏡的結合，使靈敏度進一步提高，標本又能*保存，并能加設HE染色等其他復染，有利于將被檢測物質與病變的形態學改變起來(定性與定位)，彌補了免疫熒光法的不足。
從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體進行免疫酶法染色，但實際上能用于免疫組織化學技術的酶并不多。sternbenger等人指出：用于標記的酶應具備以下六點：
1) 酶催化的底物必需是特異的，而且容易被顯示，即催化反應所形成的產物易于 在光鏡和電鏡下觀察。
2) 酶反應的終產物所形成的沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，而影響組織學定位。
3) 較易獲得純的酶分子。
4) 中性PH值時，酶分子應穩定。
5) 在酶標過程中，酶連接在抗體上，不能影響二者的活性。
6) 被檢組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似的物質，否則結果將難以判定。
上述六點中以1.2兩點zui為重要，因為并非所有的容易顯示的酶均能形成不溶性的復合物。符合上述要求的，zui為常用的酶是辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，H：：flJ)。其次是堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)，除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)等，但因其形成的不溶性色素擴散作用較大，在應用上受到很大限制。 HRP廣泛分布于植物界，因其辣根含量zui高而得名。它是由無色酶蛋白和深棕色的鐵葉結合組成的一種糖蛋白(糖占18%左右)，分子量為40000道爾頓，等電點3~9，zui適 PH為 5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸鉸溶液，其活性部分為鐵葉琳，稱輔基。酶的蛋白部分無活性。酶蛋白和鐵葉琳輔基的zui大吸收光譜分別為275urn和403urn;HRP的純度用兩者的光密度比值(M03人工衛75)來衡量，以RZ(Reinheitzahi)來表示。一般認為，標記酶的RZ值為 3.0左右，不應<2.8，RZ值越小，酶的純度越差，對于純度低，質量差的酶，需經純化后才能使用。
AKP是一種磷酸酶的水解酶，磷酸單酯酶對于連接于作用物磷酸基上的醇基沒有特異性，因它可以水解多種有機磷酸酯，生成醇和磷酸鹽離子。該酶在許多人體組織或動物組織中有分布，如肝、胎盤、白細胞、腎、小腸等。AKP的分子量為80KD，zui適PH為9.8，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響，如用二乙醇胺緩沖液(1mol/L，PH9.8)對AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用*一NaOH緩沖液則對AKP有抑制作用。AKP的活化劑有鎂和錳離子，Mg++的適應濃度為10mol/L。*、檸檬酸鹽，EDTA等對 AKP有抑制作用。AKP對溫度具有較高的敏感性，從 25℃增加到 35℃，其催化反應速度增加 1.5倍。當選用不同的底物時，AKP可催化形成不同顏色的終產物。例如，萘酚一AS一MX和快藍(Fast blue，Fh)為底物時生成藍色產物，可與HRP催化的產物形成鮮明的對比，用快紅(Fast red)代替快藍則生成紅色不溶性產物，而且內源性AKP較易清除，可以較好地避免內源性酶的干擾，使其具備了某些*的優點而日益備受重視。
GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基藍四隆(Paranitroblue Tetrazolium)，終產物比較穩定，為不溶性的藍色沉淀。從理論上講，GOD較AKP和HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性葡萄糖氧化酶，這樣可以很好地避免內源性酶的干擾。但是，GOD的分子較HRP大三倍，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，而影響酶的活性。
免疫酶法與免疫熒光法大致相同，也可以分為以下幾種。
(1)直接法
用酶標記的特異性抗體直接與標本中的相應抗原反應結合，再與酶的底物作用產生有色的產物，沉積在抗原抗體反應的部位，即可對抗原進行定性、定位以至定量研究。
直接法的*步是特異的——即酶催化底物的反應，其余步驟則是非特異的，可用各種電子供體介導。以HRP為例，HRP的底物是巴H2O2，在分解已過程中，與H2O2形成初級復合物，無電子供體存在時，反應不再繼續進行，當電子供體存在時，反應以一定的速度形成第二種復合物，繼之HRP催化H2O2所形成的中間型產物，迅速生成水，酶被還原，電子供氫體被氧化，聚合，再經氧化環化，zui后形成引哚胺多聚體，于酶反應部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰，達到定位、定性、定量的目的。
直接法簡便、快速、特異性強，非特異性背景反應低。其缺點是，每種抗原必須分別用其抗體的酶標記物，且敏感性較間接法低。
(2)間接法
間接法是先用未標記的特異性抗體(一抗)與標本中相應抗原反應，再用抗特異性抗的酶標記抗體與結合在抗原上的一抗(即特異性抗體)反應。例如，*次使用的特異性抗體(一抗)是由家兔產生的，則第二次使用的抗體(二抗)必須是酶標記的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的酶標記物(即酶標羊抗兔IgG)。然后與直接法相同，與底物反應、顯色、將抗原的性質，部位和含量檢測出來。
間接法的優點是用一種酶標抗體就可與多種特異性一抗配合而檢查多種抗原，而且敏感性也優于直接法。
(3)酶橋法
酶橋法的建立是免疫酶法重大改進的標志。將用化學交聯法將酶與抗體分子結合的技術改進為用酶和酶抗體免疫反應而結合的方法，避免了由于化學反應過程中對酶活性和抗體效價的不良影響。其基本原理是用酶免疫動物，制備價、特異性強的抗酶抗體，然后用第二抗體作橋，將抗酶抗體和特異性的*抗體(即連結在組織抗原上的抗體)連接起來，再將酶結合在抗酶抗體上，經過酶催化底物的顯色反應后，顯示出抗原所在的部位及含量。作為橋的第二抗體(即橋抗)必須對特異性抗體(一抗)和酶抗體都具有特異 性，這樣才能將二者相連起來，因此，一抗和酶抗體應由同一種屬動物產生。例如，特異性抗體和酶抗體都是兔產生的，再用羊抗兔IgG作為橋抗體就能將兩者連接起來。在此 過程中，由于任何抗體均未被酶標記，酶是通過免疫學原理與抗酶抗體結合的，避免了共價連接對酶活性的影響，提高了方法的敏感性，同時也節省了特異性抗體(即一抗)的用量。
酶橋法雖然克服酶標記抗體法的缺點，較好地保護了抗體和酶的活性，但是仍存在不足，其主要表現為①在抗酶抗體的抗血清中，含有低親和力和高親和力兩類抗體，它們作為抗原與抗體結合，主要依賴于橋抗體對它的親和力，而與其本身對酶的親和力無關，故兩者均可被連接在橋抗體上，由于低親和力的抗酶抗體與酶結合較弱，漂洗時易解離，使部分酶丟失，從而降低了方法的敏感性。②抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體，其抗原性與抗酶抗體相同，所以能與橋抗體結合，但卻不能與酶結合，這樣影響了組織抗原的顯示。為解決這些不足，70年代初，Sternberg在各種標記抗體法和酶橋法的基礎上，建立了PAP法，并加以改良，成為應用的免疫組織化學技術之一。
(4)PAP法
PAP法是酶橋法等基礎之上建立的，其基本原理與酶橋法相似，都是利用橋抗體將 酶連接在*抗體結合的部位，所不同的是，將酶和抗酶抗體制成復合物(PAP)以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結合的酶，將兩個步驟合并為一個步驟，這一重要的改進，不僅僅是簡化步驟，而具有更大的優勢，因為PAP是由3個過氧化物酶分子和2個抗酶抗體分子結合形成的一個環形分子，排列呈五角形結構，3個角辣根過氧化酶(HRP)，另2個角為抗HRP抗體，其分子量為400，000~430，000道爾頓，直徑約為20.5nm，這種結構異常穩定，沖洗時酶分子不會脫落，從而大大提高了敏感性，Petrali等報告，PAP法比酶橋法靈敏度高20倍。有人認為是免疫熒光法的100~1000倍。
PAP法應用廣泛，其主要優點為：
1) zui大限度地保存了抗體活性。
因為在所有的反應過程中，任何抗體均未被酶標記，避免了標記過程中對抗體活性的損害。
2) 靈敏度高。
由于是多層抗原抗體反應，由于免疫放大作用，使得結合在抗原抗體復合物上的酶分子增多，并且PAP法復合物性質結構穩定，這樣與酶底物反應后的呈色反應增強，使微量的或抗原性弱的抗原顯示出來，提高了靈敏度。
3) 背景淡。
酶橋法中，酶標記的非特異性抗體可與組織抗原結合，引起背景染色，給結果判斷帶來了很大的困難。
PAP法中，連接抗體中即使存在著非特異性抗體，因其不是抗IgG的特異性抗體，故不能與抗HRP抗體相結合，也就不能把PAP復合物連接在非特異性抗體上。當然PAP復合物內也可存在一些非HRP特異性抗體，假如這部分抗體能夠與橋抗體及組織成分相結合，但因其不是抗HRP抗體，所以不能與HRP結合，也就無酶活性及背景染色。背景越淡，當然越有利于結果的判斷。
PAP法的不足之處是PAP的制備較為復雜。
雙PAP法又稱雙橋法(double bridged technique)，是PAP法的重要改進，通過兩次連接橋抗體和PAP，在抗原抗體復合物上結合了比PAP法更多的酶分子，可提高敏感性達20~50倍。一般認為，雙PAP法通過下述途徑來提高敏感性，①重復的橋抗體與PAP中的抗HRP抗體的抗原未飽和位置結合，再連接PAP復合物，即在抗原之處，抗體間形成更大的抗原抗體復合物，具有多個酶分子，使免疫染色增強。②重復的橋抗體，與特異性的*抗體未飽和抗原相結合，使*抗體上結合較多的橋抗體和PAP復合物，起到放大作用。雙PAP法的不足之處是步驟多，需時長，在實際操作中，可能會帶來非特異性放大的問題而影響結果的判斷。
(5)APAAP法
APAAP——堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP)法是Mason和Moir(1983)等在PAP法的基礎上，用AKP替代HRP而建立的一種方法，都屬于未標記抗體橋聯法。APAAP法與PAP一樣，利用橋抗體將AKP連接在*抗體的結合部位，而AKP和抗AKP抗體被制成復合物(APAAP)，通過APAAP復合物中的AKP催化底物顯色以顯示抗原物質。
APAAP法的主要優點：
1) 在內源性的過氧化物酶較高的組織中進行免疫組織化學染色時，APAAP法較PAP法具有更多的優勢，僅需稍加處理就能消除內源性酶的干擾，而PAP法則困難較大。
2) 敏感性與PAP法大致相似。
3) 在血、骨髓、脫落細胞涂片的免疫細胞化學染色上具有PAP法不能替代的優勢。
4) 反應穩定，著色清楚，背景淡。
免疫酶法分為直接法、間接法、酶橋法、PAP法和APAAP法。其中的PAP法和APAAP法應用較為廣泛，不過PAP的制備較為復雜，而APAAP法建立在PAP法的基礎上，能有效彌補PAP法的不足。
