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閱讀:1060發(fā)布時間:2016-7-26
噬菌體克隆純化實驗步驟
1. 在直徑82 mm LB平極上倒入含200 μl 宿主菌的3 ml 0.7%頂層瓊脂糖,放置10 min。
2. 通過放射自顯影膠片上的雜交斑點確定陽性噬斑在原平板上的位置,用牙簽輕輕插入斑中。
3. 然后接種到步驟1制備的次級平板的頂層瓊脂糖中,此牙簽在平板上接連插30~40下。
4. 或用吸管插入陽性噬斑的位置,取一小塊環(huán)形瓊脂糖轉(zhuǎn)入1 ml SM中。
5. 加入1滴,放置1~2 h,滴定,制備3~6個平板,每個平板的噬斑數(shù)應(yīng)小于500個。
6. 次級平板置37℃過夜培養(yǎng),將噬菌斑影印到硝酸纖維素濾膜上。
7. 再依次處理、雜交、洗膜和曝光,然后在次級平板上找出對應(yīng)的陽性噬菌斑。
9. 對每個克隆,將牙簽插入雜交信號zui強的噬菌斑中,并在1 ml SM中放置5 min。
10. 將1 μl 噬菌體貯存液。1 μl 和10 μl 1:100稀釋液鋪三級平板。
11. 按以上步驟篩選第三級平板上的噬斑。
12. 重復(fù)這一純化過程,直至獲得純的噬斑為止,并將純的噬菌體保存在SM中。
噬菌體克隆純化實驗步驟
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