病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟，一、病毒的種類
病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒
1.1慢病毒
1.1.1原理
慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA 和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。
1.1.2特點(diǎn)
1） 直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合 RNAi 研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 (比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)。
2） 可以通過簡單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。
3） 可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。
4） 無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡便。
5） 可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。
1.1.3慢病毒包裝簡要流程：
1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。
2） 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。
3） 培養(yǎng) 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。
4） 病毒的純化和濃縮。
5） 分裝、- 80 ℃保存。
6） 滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。
1.2、腺病毒
1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的控制系統(tǒng)。
1.2.2特點(diǎn)
1） 幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞
2） 可以獲得復(fù)制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒
3） 病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達(dá)到 1012 PFU/mL，能有效的進(jìn)行增殖。
4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.
5） 感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。
1.2.3腺病毒包裝簡要流程
1） 構(gòu)建表達(dá) siRNA/miRNA 的腺病毒載體
2） 采用 PacI 消化純化的質(zhì)粒。
3） 消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。
4） 將病毒粗提液感染 293A 細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。
5） 分裝，-80℃保存。病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟
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