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技術文章

流式細胞凋亡實驗步驟

閱讀:226發布時間:2016-3-16

一、收集細胞
 
收集細胞{數目約(1~ 5)×106個/mL},500~ 1 000 r/min離心5 min,棄去培養液。
 
二、細胞洗滌
 
3 ml PBS洗滌1次。
 
三、乙醇固定
 
離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定,4℃,1-2小時。
 
四、細胞重懸
 
離心棄去固定液,3 mlPBS重懸5 min。
 
五、細胞過濾
 
400目的篩網過濾1次,500-1000 r/min離心5 min,棄去PBS。
 
六、染色
 
用1 ml PI染液染色,4℃避光30 min。
 
七、流式細胞儀檢測
 
PI用氬離子激發熒光,激光光波波長為488 nm,發射光波波長大于630 nm,產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。
 
八、結果判斷
 
在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細胞與正常細胞相比,前散射光降低,而側散射光可高可低,與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時,先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片,在PI熒光的直方圖上,凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0,則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45,可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準,兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。


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