篩選RNA結合蛋白實驗，材料與設備
1. 通過比較 β-半乳糖苷酶表達差異導致的細菌克隆顏色變化檢測多肽與 RNA 間的作用
(1) 儲存液：氨芐*（100 mg/ml)，*（40 mg/ml，甲醇溶液），X-Gal（40mg/ml，二甲基甲酰胺溶液），IPTG（100 mmol/L），可在 -20℃ 保存數月。
(2) 蛋白胨培養基：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，定容 1 L，滅菌后保存。
(3) 蛋白胨平板：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，15 g 瓊脂粉，定容至 1 L，高壓滅菌；冷卻后加入 50 μg/ml氨芐*，15 μg/ml *，80 μg/ml X-Gal，50 μmol/L IPTG。
(4) N-表達質粒（pBR322-衍生的，具氨芐*抗性），N-報道基因表達質粒 ( pACYCJ84-衍生的，具*抗性）。
(5) E.coil N567 感受態細菌，分別含有 N-表達質粒和 N-報道質粒（CaCl2 法制備）。
2. 通過 β-半乳糖苷酶活性檢測定量比較多肽與 RNA 間的相互作用
(1) 儲存液：1 mol/L 葡萄糖，1 mg/ml 維生素 B1，1 mol/L MgSO4，0.2 μm 濾膜過濾除菌；4 mg/ml 鄰-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（Onitrophrny-β-D-garactopyranoside，ONPG）溶解于 A 溶液，4℃ 保存；1 mol/L NaCO3，0.1% SDS，氯仿。
(2) A 溶液：1.5 g K3HPO4，4.5 g KH2PO4，1.0 g (NH4)2SO4，0.5 g 檸檬酸鈉2H2O，加水定容至 1 L，高壓滅菌后保存。
(3) Z 緩沖液：0.06 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L KCl，0.001 mol/L MgSO4，0.05 mol/L β-巰基乙醇。
篩選RNA結合蛋白實驗，3. 重組庫的制備
(1) 儲存液：200 mmol/L DTT ( -20℃ 保存）；2.5 mmol/L dNTP 混合物（-20℃ 保存）；0.5mol/L EDTA，pH 8.0；酚：氯仿：異戊醇（25：24：1 ) 溶液；3 mol/L 乙酸鈉 ( pH 5.2）；50X TAE (242 g Tris 堿，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA，加水定容至 1 L）。
(2) 20 μmol/L 含隨機 DNA 序列庫的簡并寡核苷酸，末端為固定序列，5' 端和 3' 端分別帶有 NcoⅠ 和 BsmⅠ 酶切位點。
(3) 20 μmol/L 末端與簡并寡核苷酸 3' 端固定序列互補的引物寡核苷酸。
(4) 酶及公司附帶的緩沖液：NcoⅠ（10 U/μl），BsmⅠ（5 U/μl），測序酶 2.0（13 U/μl），T4 DNA 連接酶（1 U/μl）。
4. 從隨機重組庫中篩選新的 RNA 結合多肽
(1) N-表達質粒組合文庫（N-cxpressor plasmid combinatorial library )。
(2) E.coli N567 感受態（含報道基因的表達質粒）。
(3) 蛋白胨培養基，平板，氨芐*（100 mg/ml )，*（40 mg/ml )，甲醇溶液。
(4) 滅菌的 96 孔培養板。
篩選RNA結合蛋白實驗，二、操作方法
1. 通過比較 β-半乳糖苷酶表達差異導致的細菌克隆顏色變化檢測多肽與 RNA 間的作用
(1) 以 pBR N-表達質粒轉化 N567/pAC 報道菌：取 10 ng（1~10 μl）的 pBR 質粒與 50~100 μl的感受態報道菌混勻，冰浴 10 min，37℃ 2 min 后快速轉移至冰浴，然后加入 0.5~1 ml 的蛋白胨培養液，37°C 振搖 1 h。
(2) 取 1/5~1/10 的轉化混合物涂布于含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培養板，34℃ 培養 48 h。
(3) 通過與陽性/陰性對照進行顏色比較，采用半定量評分的方法對抗轉錄終止活性進行檢測：含野牛型 nut 報道質粒而不含N-表達質粒的陰性對照菌株評分為 0；同時含野生型 nut 報道質粒和 N-表達質粒的陽性對照菌株評分為 + + + + +。
2. 通過 β-半乳糖苷酶活性檢測定量比較多肽 RNA 間的相互作用
(1) 挑取單個藍色的細菌克隆，用含有相應抗生素的蛋白胨培養液 37℃ 培養過夜。
(2) 稀釋 50 倍過夜培養物至 3~5 ml 培養液（含 22.4 mmol/L 葡萄糖，1 μg/ml 維生素 B1，1 mmol/L MgSO4 及抗生素）中。37℃ 振搖培養至 OD600 約為 0.2 ( 3~6 h)。加終濃度為 0.5 mmol/L 的 IPTG，繼續培養至 OD600 達 0.4~0.5，測定并記錄 OD600 值。
(3) 混合 0.1 ml 的細菌培養物和 0.9 ml 的 Z 緩沖液，并加入 25 μl 的氯仿和 12 μl 的 0.1%SDS，劇烈振蕩 10 s 混勻，此時溶液應變混。10~15 s 后加入的 ONPG 溶液，于 28°C 孵育。
(4) 當溶液變黃時，加入 0.4 ml 1 mol/L NaCO3，終止反應。記錄從加入 ONPG 至反應終止的時間。
(5) 于 11000 g 離心 1 min 去沉淀，讀取 OD420 和 OD550 數值，用公式計算 β-半乳糖苷酶活性，酶活力=1000X（OD420一1.6XOD550）/（tX0.1XOD600），t=反應時間。
，3. 重組庫的制備
(1) 取 20 μl 寡核苷酸引物、15 μl 簡并寡核苷酸、100 μl 測序酶緩沖液和 272.3 μl 水，混勻。加熱至 65℃ 再緩慢冷至室溫使引物與簡并寡核苷酸退火。
(2) 再加入 25 μl DTT、60 μl dNTP 混合物、7.7 μl (100 U) 測序酶，37℃ 孵育 20 min。加入 4μl EDTA 終止反應。（在加入測序酶前留取少量樣品以便通過 4% 瓊脂糖凝膠電泳與延伸產物比較。）
(3) 加 500 μl 酚：氯仿：異戊醇溶液，劇烈混勻，11000 g 離心 1 min，取上層水相至一干凈離心管內；加 500 μl氯仿，劇烈混勻，11000 g 離心 1 min，取上層水相至一干凈離心管。用 1/10 體積的 3 mol/L 乙酸鈉和 2.5倍體積乙醇沉淀 DNA。
(4) 用 290 μl 水，50 μl NEB 緩沖液 2 和 40 μl DTT 溶解 DNA ( 留取少量樣品以便通過 4%瓊脂糖凝膠電泳與酶切產物比較）。加 40 μl NcoⅠ，37°C 反應 2 h ( 留取少量樣品）；加 80 μl BsmⅠ，65℃ 反應 2h ( 留取少量樣品）。按前面操作同樣進行酚抽提和乙醇沉淀，4% 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切程度。
(5) 用 12%、1.6 mm 丙烯酰胺膠分離酶切的 DNA，切下相應膠條，用 300 mmol/L 乙酸鈉洗脫 DNA 后用 2.5 倍體積乙醇沉淀。
(6) 對于 20 μl 體積的連接反應，加入 50 ng NcoⅠ和 BsmⅠ消化的質粒、5 ng 待插入的 DNA (上一步操作獲得）、1X 連接緩沖液、2 μl T4 DNA 連接酶。將連接混合物轉化 N567 菌株。轉化菌的接種密度保持在每個直徑為 100mm 的平板上含 2000~3000 個克隆。
4. 從隨機重組庫中篩選新的 RNA 結合多肽
(1) 初篩：取制備好的重組庫（200 μl 的連接產物）加入 1.5 ml 的感受態報道細胞，涂布于直徑為 150 mm的含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培養板。挑取藍色克隆（即便是較弱的藍色克隆也予以挑取），分別重懸于 96 孔板內（每孔加 100 μl含抗生素的蛋白胨培養液）。細菌培養過夜至生長平臺期，合并收集細菌，堿裂解法結合瓊脂糖凝膠電泳純化獲取 pBR 質粒。
(2) 二次篩選（排除報道質粒自發突變造成的假陽性）：將獲得的陽性質粒共同轉化報道細胞，涂板篩選，挑取陽性克隆接種于 3 ml 含氨芐*的蛋白胨培養液中，過夜培養至生長平臺，分別提取各個克隆的質粒。
(3) 第三次篩選 ( 排除與靶 RNA 非特異結合造成的假陽性）：將獲得的陽性質粒分別同時轉化含特異性報道質粒的菌株和含非特異性報道質粒的菌株，排除在兩類菌株中都能激活報道基因的克隆。
(4)第四次篩選（排除表達質粒上隨機庫以外的其他部位的堿基突變產生的假陽性）：對第三次篩選得到的陽性克隆進行測序，然后按測序結果再合成陽性序列，重新克隆人 pBR，再進行一次抗轉錄終止檢測。
