實(shí)驗(yàn)方法原理
免疫PCR主要由兩個(gè)部分組成，*部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量zui終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。*步中，首先用待測抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素（Protein A-Streptavidin）嵌合體（重組融合蛋白）中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與*化的pUC19（質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19）中的*反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，*步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。
PCR由以下五部分構(gòu)成：
（1）待測抗原；
（2）*化抗體；
（3）親和素（連接分子）；
（4）*化DNA；
（5）PCR擴(kuò)增。
主要程序：
（1） 抗原+*化抗體→抗原-*化抗體復(fù)合物；
（2） 加親合素→抗原-*化抗體-親合素復(fù)合物；
（3） 加*化DNA→抗原-*化抗體-親合素-*化DNA；
（4） PCR擴(kuò)增*化DNA部分。
實(shí)驗(yàn)材料 抗原樣品
試劑、試劑盒 包被緩沖液洗滌液稀釋液瓊脂糖凝膠
儀器、耗材 微滴板電泳儀電泳槽
實(shí)驗(yàn)步驟
一、制備*化DNA
將噬粒 BLuescript skt，用*標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即為*化DNA。
二、免疫PCR模式
1. 試劑
包被緩沖液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗滌液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀釋液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1 mg/ml）。
2. 操作
（1） 包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃過（約15 h），用洗滌液洗板3次×5 min。
（2） 封閉
每孔加200 μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80 min，洗板數(shù)次。
（3） 抗原抗體反應(yīng)
用釋釋液1:8 000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50 μl，室溫（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未結(jié)合的抗體分子。
（4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)
每孔加入50 μl用稀釋液稀釋的已與*-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50 min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10 min，再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
（5） PCR
實(shí)驗(yàn)條件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl2、明膠（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每種0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。
三、PCR周期
PCR前，用紫外線（UV）（254 nm）照射上述反應(yīng)混合物，然后將之加入到微滴板孔中，每孔40 μl，再加20 μl UV照射的石蠟覆蓋，按下述溫度在PCR儀上進(jìn)行PCR周期：起始變性94℃5 min；30個(gè)周期：變性94℃5 min，退火58℃1 min，延伸72℃1 min，zui后延伸72℃ 5 min，得到的PCR產(chǎn)物為特定的261 bp的片段。
1. 用0.85% NaCl將細(xì)菌溶液稀釋至一定濃度；
2. 加50 μl于微孔板內(nèi)，4℃過。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（加50 μl 0.85% NaCl于另一孔內(nèi)）；
3. 用400 μl的0.05% 溫20pBS（以下簡稱TPBS），洗滌五次；
4. 加入2.25%的100 μl正常山羊血清（NGS） PBS封閉2小時(shí)；
⒌ 用含0.15% NGS的TPBS洗3次；
6. 加入100 μl用0.75% NGS適當(dāng)稀釋的單克隆抗體（內(nèi)含100 μg的鮮魚精DNA），室溫孵育30 min；
7. 用TPBS洗滌五次；
8. 加入50 μl適量稀釋的*化抗鼠IgG抗體，室溫孵育30 min；
9. 用TPBS洗滌五次；
10. 加入60 μl適量稀釋的*化DNA和親和素，室溫孵育30 min；
11. 用TPBS洗滌五次，再用HPLC級(jí)水洗三次；
12. PCR擴(kuò)增：加入50μl PCR反應(yīng)液（內(nèi)含T3和T7引物），95℃ 60 s，50℃ 110 s，72℃ 110 s，循環(huán)30次。取PCR產(chǎn)物10 μl于1.7%瓊脂糖凝膠上電泳，和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)相比較，在相應(yīng)的位置郵現(xiàn)電泳帶為陽性。必需時(shí)將電泳結(jié)果照像，進(jìn)行定量分析。
收起
其他
一、發(fā)展
免疫PCR技術(shù)目前尚處于研究階段，還沒有一個(gè)十分成熟和滿意的方法，配套試劑尚缺乏，所以應(yīng)用的還不多，在報(bào)道的幾種方法中均是用一些已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)。Sano，Ruzicka和Hong zhou分別用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重組人原癌基因產(chǎn)物ETS；蛋白作為待檢抗原進(jìn)行，他們的結(jié)果均表明的敏感性比ELISA高105倍，且PCR產(chǎn)生的背景信號(hào)很弱，可以檢測到幾百個(gè)分子的抗原，在理論上可以檢測到一個(gè)分子抗原，因此，特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。目前介紹的還存在一些缺點(diǎn)，在報(bào)道的文獻(xiàn)中均采用待檢抗原直接吸附固相，這樣固相的均質(zhì)性必然對(duì)結(jié)果有很大的影響；同時(shí)檢測的樣品液中其它成分也可以吸咐固相，極易產(chǎn)生背景過高或度下降。另外，有些難于吸咐固相的抗原也就不能用檢測，連接分子的特異性和均質(zhì)性對(duì)PCR影響很大，從理論上看Hong zhou的*標(biāo)記抗體和DNA以及用游離的鏈親和素連接抗體和DNA是一比較理想的方法，但是如能做到*化抗體、親和素和*化DNA3個(gè)分子預(yù)先連接一個(gè)復(fù)合物，那么將簡化實(shí)驗(yàn)過程。PCR擴(kuò)增過程相對(duì)簡單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應(yīng)管內(nèi)，這必然導(dǎo)致很大的誤差，經(jīng)放大可產(chǎn)生顯著差異。固相也可以直接采用某些PCR反應(yīng)管，并且可以直接用一般的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，但沖洗過程相對(duì)復(fù)雜一些。具有非廣泛的應(yīng)用前景，十分有必要進(jìn)一步完善的實(shí)驗(yàn)過程和配套試劑的研制。
二、應(yīng)用
熒光PCR是分子診斷的熱點(diǎn)技術(shù)，它將*的定量PCR與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)相結(jié)合，西安天隆生產(chǎn)的國產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時(shí)也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了*手段。即使在發(fā)達(dá)國家，熒光定量PCR儀和基因擴(kuò)增儀都被廣泛用于臨床及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究。由于其*的靈敏度、極寬的檢測范圍，以及定量、方便快速、無窗口期等優(yōu)點(diǎn)，美國FDA及中國國家標(biāo)準(zhǔn)已將定量PCR儀規(guī)定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的*儀器。
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