通過藥物抗性的水平傳播分析
實(shí)驗(yàn)材料 病毒細(xì)胞
試劑、試劑盒 polybrene小牛血清DMEM
儀器、耗材 培養(yǎng)皿濾膜
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 在開始分析的前1天，按1：50將NIH 3T3細(xì)胞分傳于3個(gè)6 cm 培養(yǎng)皿中。將1個(gè)培養(yǎng)皿標(biāo)記為陽性對照，1個(gè)為陰性對照，1個(gè)用于待測病毒原液。
2. 含有選擇標(biāo)記的待測病毒的制備：加0.01 ml 800 μg/ml polybrene至1 ml 待測病毒上清中，通過0.45 μm 濾器過濾。
3. 含有選擇標(biāo)記的陽對照的制備：制備1 ml 無輔助病毒的病毒原液與10~100 CFU輔助病毒原液的混合液。加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通過0.45 μm 濾器過濾除菌。
4. 陰性對照病毒原液的制備：制備1 ml 無輔助病毒的病毒原液，加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通過0.45 μm濾器過濾除菌。
5. 用各病毒原液感染培養(yǎng)皿上的細(xì)胞。將感染后的3個(gè)培養(yǎng)皿置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中溫育1~3 h以利于吸收，加4 ml DMEM-10培養(yǎng)至細(xì)胞匯片。
6. 將細(xì)胞按1：50分傳于新的6 cm 培養(yǎng)皿中。3個(gè)培養(yǎng)皿中每個(gè)僅傳一個(gè)培養(yǎng)皿，棄去原來感染的細(xì)胞的無用的部分。使polybrene的終濃度在2 μg/ml 培養(yǎng)至細(xì)胞長到50%~90%匯片。
7. 棄去培養(yǎng)液換以半量的新鮮DMEM-10。再培養(yǎng)2~3天。
8. 收獲生長匯片的細(xì)胞的zui終的上清。經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，加polybrene至終濃度8 μg/ml。保存于-70℃~ -80℃，或立即用于滴定及分析標(biāo)記抗性。
9. 在上清滴定前1夭，將新鮮的未經(jīng)感染的NIH 3T3細(xì)胞按1：10或1：20分傳于3個(gè)6 cm 培養(yǎng)皿中。用各種上清1 ml 感染口NIH 3T3細(xì)胞，并進(jìn)行滴定的各步操作。如果出現(xiàn)了幾千個(gè)neo抗性的克隆就說明原始的待測病毒原液中污染了輔助病毒。
反轉(zhuǎn)錄酶分析法
實(shí)驗(yàn)材料 病毒
試劑、試劑盒 SSC乙醇
儀器、耗材 滴定板濾紙離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 加50 μl RT反應(yīng)混合物于96-孔微量滴定板的各孔中。每個(gè)待測或?qū)φ諛悠氛家豢住＜?0 μl 病毒上淸，蓋上平板，置于37℃培養(yǎng)箱中溫育1~2 h。
2. 將各反應(yīng)液10 μl 點(diǎn)于一張2.5 cm 直徑的圓形DE52或DE81濾紙上，其上蓋一張塑料薄膜用2號鉛筆做標(biāo)記。
3. 將濾紙置于一個(gè)盤中，加2XSSC覆蓋。室溫下在搖床上輕輕搖動冼滌20 min 棄去SSC重復(fù)洗滌步驟2次。在95%乙醇中浸泡1 min，空氣中晾干約10 min。
4. 在閃爍計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)或用感光片曝光。
在Tris-Tricine緩沖系統(tǒng)中電泳
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 Tricine樣品緩沖液考馬斯亮藍(lán)染色液乙酸
儀器、耗材 電泳儀離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 按“Laemmli凝膠電泳法"的步驟1~7，配制溶液并灌制分離膠和積層膠。
2. 制備樣品，但采用2×Tricine的樣品緩沖液，加樣前樣品于40℃處理30?60 -11。多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物用作多肽分離的對照。
3. 組裝電源裝置并加樣。但加樣孔是以Tricine陰極緩沖液或水加以沖洗并以之充滿；在電泳裝置的下緩沖液槽加入陽極緩沖液，上緩沖液槽加入陰極緩沖液。
4. 連接電源，在30 V 恒壓下電泳1 h 后，接著在150 V 恒壓下電泳4 h。使用熱交換裝置使電泳緩沖液槽溫度維持室溫水平。
5. 當(dāng)考馬斯亮藍(lán)G-250示蹤染料到達(dá)凝膠的底部時(shí)，將電壓調(diào)回零并斷開電源。
6. 取出凝膠，在考馬斯亮藍(lán)G-250染色液中染色2 h，接著在10%乙酸水溶液中脫色，每隔30 min 換液1次，直至背景干凈為止，需要更高檢測敏感度時(shí)，推薦采用銀染的方法。
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