正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)別離以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照操控試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證試驗(yàn)成果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
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實(shí)驗(yàn)條件的挑選
 

在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)條件的挑選是很重要的，其間包含：
 

（1）酶標(biāo)記抗體工作濃度的挑選：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采納“方陣法”（包被物、待檢樣品的參閱品及酶標(biāo)記抗體別離為不同的稀釋度）在正式試驗(yàn)體系里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
 

（2）包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)刻及其蛋白量也有一定影響,一般多選用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，調(diào)查陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于大都蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg/ml。
 

（3）固相載體的挑選：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在運(yùn)用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行反響，調(diào)查其顯色反響是否均一性，據(jù)此判明其吸附功能是否良好。
 

（4）酶的底物及供氫體的挑選：對(duì)供氫體的挑選要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)運(yùn)用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物效果一段時(shí)刻后，應(yīng)參加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反響。一般底物效果時(shí)刻，以10-30分鐘為宜。底物運(yùn)用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。