T細胞在體外培養時,受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后,可出現代謝旺盛、蛋白質和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞,此稱為淋巴細胞轉化現象。淋巴細胞轉化率的高低,可以反映機體的細胞免疫水平,因此,可作為測定機體免疫功能的指標之一。
本實驗采用形態學方法進行淋巴細胞轉化試驗。T淋巴細胞在體外培養過程中受有絲分裂原如植物血凝素刺激后,轉化為體積較大的母細胞,胞漿增多而深染,核增大并可見核仁裂,計數轉化細胞的百分率可反映機體的細胞免疫功能。
【材料】
1.RPMLl640培養液(用前調至含小牛血清10%、*100u/m1、*μg/m1,用NaHCO3調pH至7.2-7.4)。
2.PHA(用RPMIl 640基礎培養液配成1000μg/m1)。
3.吉姆薩染液。
4.離心機、恒溫箱、計數器及顯微鏡等。
【方法】
1. 取無菌肝素抗凝血0.1m1,加入1.8m1細胞培養液中,同時加入PHA0.1m1,對照管不加PHA,將細胞置37℃、5%CO2培養3天,每天搖動1次。
2. 2500r/min,離心10min后棄上清液,留0.2m1沉淀細胞制片,迅速吹干。
3. 吉姆薩染色10一20min,水洗,干燥。
4. 油鏡計數200個淋巴細胞中轉化的細胞數,計算轉化率。
【注意事項】
1.培養基成分對轉化率影響較大,注意其有效期。
2.小牛血清用前需滅活。
3.培養時要保證有足夠的氣體,
4.PHA劑量過大對細胞有毒性,PHA轉化反應劑量一般10m1,培養瓶內液體總量不要超過2m1,太小不足以刺激淋巴細胞轉化,試驗前應先測定。
【結果觀察】
1.淋巴母細胞的形態學標準是細胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構造與
核仁的有無。可以見到以下幾種類型細胞。
(1)成熟的小淋巴細胞:與未經培養的小淋巴細胞一樣為6-8μm,核染色致密,無核仁,核與胞漿比例大,胞漿染色為輕度嗜堿性。
(2)過渡型淋巴細胞:比小淋巴細胞大,約l0-20μm,核染色致密,但出現核仁,此為與成熟小淋巴細胞鑒別要點。
(3)淋巴母細胞:細胞體積增大,約20-30μm,形態不整齊,常有小突出,核質染色疏松,有核仁l-2個,胞漿變寬,常出現胞漿空泡。
(4)其它細胞:如中性粒細胞在培養72h后,絕大部分衰變或死亡,呈碎片。
2.淋巴細胞轉化率的計算:按上述分類檢查推片頭、體、尾三部分,計數200個淋巴細胞,計算過度型和淋巴母細胞百分率。在正常情況下,PHA誘導的淋巴細胞轉化率為60%一80%,如為50%一60%則偏低,50%以下則為降低。
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