以下是影響ELISA檢測的關鍵要素，也是眾多ELISA用戶在試驗中經常遇到的問題及處理方案：
問：為什么試驗進程中孵育、洗刷需求振動？怎么振動？
答：振動孵育使反響更充沛，振動洗刷使布景更潔凈。主張運用酶標96孔微孔板振動器。孵育進程振動，能夠加速、加強抗原抗體間的相互磕碰觸摸，使得反響進程愈加*，OD值通 常會比未振動孵育的成果要高；洗刷進程振動，能夠使洗板更潔凈，在很大程度上能下降布景 值，一起能夠進步試劑盒檢測的靈敏度。
問：何時停止ELISA反響？
答：ELISA試驗終究需求酶催化底物顯色反響來完結，在zui合適的時刻停止反響是ELISA試驗成功的重要要素。在HRP-TMB酶反響系統中，當zui高濃度規范品色彩不再變深，倒數2-3個濃度標準品色彩開端有淺藍色時，便需求停止反響；或許也能夠根據zui高濃度規范品孔在620nm的OD 值來決議，OD620=0.9-0.95之間時即可停止。
問：為什么酶標儀讀數時有必要選用雙波長？
答：首要，酶標儀運用前有必要預熱10-15min，使測讀成果更穩定。其次，ELISA試驗選用雙波長測定吸光度，能夠掃除單波長檢測時的測定攪擾（標本的濃度，攪擾色等）。一般選用zui大 波長作為參照波長，在參照波長下，檢測物的吸光值zui小，檢測波長和參照波長的吸光值之差 能夠消除非特異性吸收；因此，雙波長測定，可zui大極限的消除指紋、雜質及不透光的物質對 酶標儀讀數帶來的差錯，以保證試驗數據的度。
問：為什么一切試劑和檢測樣本要平衡至室溫后再進行加樣操作？
答：溫度是ELISA結合反響的重要影響要素。為了使一切樣本在共同的溫度下反響，試驗前務 必將一切試劑平衡至室溫，包含檢測樣本。防止因溫度的動力學反響差異而導致ELISA檢測結 果的不。
問：為什么規范曲線線性較差？
答：依照引薦方法保存規范品；溶解規范品之前需時間短離心，*搜集粉末；保證規范品*溶解和混勻（大約10min），然后再進行后續的系列稀釋過程，保證每一步都充沛混勻且 移液；顯色的恰當停止；選擇合適的數學擬合方程制作規范曲線。
問：ELISA試驗為什么有必要設置復孔？
答：為取得更的試驗成果，強烈主張規范品及樣本進行復孔檢測。 由于復孔檢測能夠：
★核算平均值，保證試驗成果更；
★處理試驗中誤操作形成的跳孔現象；
★核算CV值，對試驗的操作和試劑盒的精密度進行評價。