請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 ng/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比釋），分別配制成5,000 ng/ml，2,500 ng/ml，1,250 ng/ml，625 ng/ml，312 ng/ml，156 ng/ml，78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制2,500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要0.5ml ）5,000 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3、 樣品稀釋液：1×20ml。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋（如：10 檢測溶液A /990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。

7、檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/LH2SO4）。

11、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2、微量加液器及吸頭，EP管

3、蒸餾水或去離子水，濾紙標(biāo)本的采集及保存

1、血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、其它生物標(biāo)本：請1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保 存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4、樣本處理：血清或血漿標(biāo)本*稀釋200倍。標(biāo)本使用0.02 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。

注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周，-20不應(yīng)超過1個月，-80不應(yīng)超過2個月;標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解;試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37 溫育1小時。

3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4、每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。

5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、每孔加底物溶液90 ，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。

7、每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。

8、立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

注：

1、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育"時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。*設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、試劑配制：Detection A及DetectionB在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀 釋而造成濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。

6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。