蛋白質(zhì)技術(shù)專題：*的測定實(shí)驗
*（glutathiose,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH）是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由*、半*及*組成。存在于幾乎身體的每一個細(xì)胞。
實(shí)驗方法
雙抗夾心ELISA法
免疫組織法
實(shí)驗方法原理 先將康體包被于反應(yīng)板上，加入待測抗原，然后再加入酶標(biāo)康體，顯色后即可測得抗原含量。
實(shí)驗材料 抗體
試劑、試劑盒 碳酸鹽緩沖液 Na2CO3 磷酸鹽緩沖液 NaCl KCl TMB 二甲基亞砜 牛血清蛋白
儀器、耗材 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱
實(shí)驗步驟 一、材料準(zhǔn)備
1. 包被液：0.05 mol/l（pH9.6）碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.159 g，NaHCO3 0.294 g，用蒸餾水溶解后，定容至100 ml。
2. PBS-T洗滌液：0.01mol/ pH7.4磷酸鹽-氯化鈉緩沖液：NaCl 8.0 g，KH2PO4 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，吐溫-20 0.5 ml，用蒸餾水溶解后，定容至1000 ml。
3. 底物溶液3，3’，5,5‘-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）貯存液及應(yīng)用液：
（1）0.1 mol/l pH6.8 PBS：Na2HPO4·12H2O 1.09 g，NaH2PO4·H2O 6.05 g，蒸餾水溶解后定容至500 ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
（2）TMB貯備液：TMB 60 mg 溶于10 ml 二甲基亞砜（DMSO）中4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
（3）TMB應(yīng)用液：臨用前取0.1 mol/l pH6.0 PBS 10 ml，TMB貯備液100 ul，30%H2O2 15 ul 混勻即可。
二、實(shí)驗步驟
1. 抗體包被
（1）抗體用包被液稀釋至20 ug/ml，加入聚苯乙烯反應(yīng)板中每孔100 ul，加蓋后放4℃過夜。
（2）傾去孔內(nèi)液體，加入洗滌液后靜置3 min，傾盡洗滌液，重復(fù)洗滌3次。
（3）將反應(yīng)板口在吸水紙上，以除盡液體。
2. 封閉：每孔加入200 ul封閉液，37℃孵育60 min，然后洗滌3次。
3. 加入待測血清，37℃溫育1~2 h，洗滌3次。用稀釋液作對照孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是用不容稀釋度的純GST-π。
4. 加酶標(biāo)抗體：按要求稀釋抗GST-π-IgG-HRP，每孔100 ul，37℃溫育1 h，然后洗滌5次，扣在吸水紙上吸干水分。
5. 顯色：加入TMB應(yīng)用液，置室溫反應(yīng)15~30 min，加入50 ul 2 mol/l H2SO4，穩(wěn)定3~5 min，即可比色。
6. 比色：用酶標(biāo)儀，以PBS-T孔為對照，波長450 nm，測各孔光吸收度（A），查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可測得GST-π含量。
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