蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠
英文名稱:Protein AG-Berpharose FF
貨號:B2834
規格:1ml
產品介紹
蛋白A蛋白G瓊脂糖凝膠FF是將重組蛋白A蛋白G融合蛋白鍵合在瓊脂糖凝膠微球上形成的親和分離介質。同單獨的蛋白A或蛋白G分離介質相比,具有更寬廣的結合范圍,同時融合后的r-PAG降低了對pH值的依賴,允許在pH5-8進行結合。本產品多用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究,及抗體固定及其它相關研究。
規格
1ml(預裝柱)、5ml(預裝柱)、10ml(預裝柱)、25ml、100ml、500ml 純化流程
以免疫共沉淀(Co-IP)舉例:
結合緩沖液:20mM磷酸緩沖液、150mMNaCl、pH7.0
洗脫緩沖液:0.1M甘-氨酸,PH3.0
中和緩沖液:1 M Tris-HCl,pH 8.5
(注:所用過柱液體在使用之前建議用至少小于等于0.45μm濾膜過濾)
(1)樣品預處理:細胞、植物、動物組織裂解液樣品,最終總蛋白濃度選擇在0.5-1.0ug/ul范圍內為宜,上樣前要確保樣品溶液擁有合適的離子強度和pH值(如:可以用結合緩沖液對樣品液進行稀釋或透析);哺乳動物細胞內有多種成分可以和IgG發生結合,可能會在后續免疫印跡中出現非特異性條帶,可通過加入Normal IgG和Protein AG-Berpharose FF的方式預處理裂解液樣品,以降低非特異性結合。
(2)抗原-抗體復合物制備:將抗體與含有目的蛋白的裂解液混合,室溫震蕩孵育30-60min(或4-8度孵育過夜),形成抗原-抗體復合物(可根據已優化好的抗原抗體結合條件處理)。
(注意:抗體的加入量要依據填料量,抗體的加入量過多會影響到抗原-抗體混合物與填料的結合,故建議抗體加入量為填料載量的80%)
(3)填料平衡:取適量的Protein AG Berpharose FF加入到2ml離心管中,500 r離心1min,棄上清,加入0.5ml結合緩沖液,懸浮填料,500 r離心1min,棄上清,重復兩次。
(4)抗原-抗體復合物的吸附:將抗原-抗體復合物加入到平衡好的填料中,均勻,在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管,促使樣品和填料充分接觸并吸附,約30min后,500 r離心1min,取上清液,留樣檢測。
(5)除雜清洗:向上述離心管中加入0.5ml的結合緩沖液,懸浮填料,進行清洗,500 r離心1min,吸棄上清,重復兩次。
(6)抗原洗脫:
①非變性洗脫法(洗脫的樣品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析):向離心管中加入5倍柱體積的洗脫緩沖液,用移液器吹打5次,混勻,然后在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管10min后,500 r離心1min,吸取上清液,收集洗脫組分,即為目標抗原,收集上清液至新的離心管中,并立即加入十分之一體積的中和緩沖液中和緩沖液調節其pH至中性,用于后期功能分析。
②變性洗脫法(洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測):向離心管中加入25ul 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均 勻,95℃加熱5min。然后進行離心,200 r離心1min,收集上清液,進行SDS-PAGE電泳,轉膜后進行 Western分析。
蛋白AG融合蛋白瓊脂糖凝膠
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