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                                          real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測

Real-Time PCR 技術(shù)，又稱實(shí)時(shí)定量熒光PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。

服務(wù)說明

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟

1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。

2）取100mg組織，加入到勻漿器中。

3）充分研磨直至無可見組織塊。

4）13000g離心10min取上清。

5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。

6）4℃下13000g離心8min。

7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。

8）-20℃放置15min。

9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。

10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。

11）4℃下13000g離心5min。

12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。

13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。

14）55℃孵育5min。

2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌，無RNA酶）

1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

2）加入1μl oligo(dT)15。

3）用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。

4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。

5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。

6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

3、定量PCR

1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。

2× qPCR Mix  12.5μl

7.5μM基因引物 2.0μl

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

2）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。

2×qPCR Mix  12.5μl

7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl

反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

3）PCR擴(kuò)增

預(yù)變性    95℃，10min

循環(huán)（40次）      95℃，15s→60℃，60s

溶解曲線   75℃→95℃，每20s升溫1℃

4、結(jié)果處理

ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)

B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)

K=A-B

表達(dá)倍數(shù)=2-K

real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測

注意事項(xiàng)

1、長度：15—30bp。 

2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間。

3、堿基分布的隨機(jī)性

4、引物自身：不要含有自身互補(bǔ)序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。

5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。

6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。

7、3’末端：如果可能的話，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。

8、設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，上下游引物要跨內(nèi)含子，以消除基因組DNA的干擾。

9、引物設(shè)計(jì)好后再NCBI上進(jìn)行序列比對，檢查是否可能有錯配產(chǎn)物擴(kuò)增。

10、引物設(shè)計(jì)要注意種屬。