免疫熒光四標五色（芯片）

服務介紹：　

組織芯片的免疫熒光檢測，是將許多不同個體組織標本以規則微陣列方式排布于同一載玻片上，同時進行相同指標的免疫熒光檢測。組織芯片熒光四標實驗是在同一張組織芯片上對四個抗原進行同時標記，從而實現定性，定位，半定量分析。 組織芯片的免疫熒光檢測，標本體積小, 標本信息含量大 , 一次性實驗即可獲大量結果。實驗條件更易控制一致，減少批間批內誤差，結果更準確。

實驗流程：

1石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。中火8min停火8min轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織來確定）

3 畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，封閉內源性的過氧化物酶，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

4 血清封閉:滴加BSA，封閉30min。（一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉）

5 加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

6 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7 加CY3-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加CY3-TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

8 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

9 加第二種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

10 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。

11 加FITC-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

12 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

13 加第三種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

14 加對應的HRP標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

15 加647-TSA：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加TSA，避光室溫孵育10min. 孵育完后，玻片置于TBST中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min

16 微波處理：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內加熱處理，中火8min停火8min轉中低火7min，去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

17 加第四種一抗：在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4°C孵育過夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）

18 加594標記的二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的594標記的熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。孵育完后，玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

19 DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

20 自發熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

21 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

22 鏡檢成像：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發波長330-380nm，發射波長420nm，發藍光；FITC激發波長465-495nm，發射波長515-555 nm，發綠光；CY3激發波長510-560，發射波長590nm，發紅光. 647熒光激發波長 608-648nm, 發射波長672-712,，原本為正紅色，為了與CY3區分開，我們設定為粉色光。 594激發波長594nm，發射波長615nm. 我們設定為紫紅色。

技術原理介紹：

主要原理是基于酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification），以下簡稱TSA技術。TSA是一種基于辣根過氧化物酶HRP的催化活性對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記的酶學檢測方法。技術主要原理為熒光標記的酪胺在HRP與H2O2的作用下變為活化的酪胺，附著在靶標周圍的蛋白酪-氨酸殘基上。此結合是共價結合，而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結合，通過微波修復處理，第一輪的一抗二抗被洗脫，熒光標記的酪胺依然附著在靶標周圍。在檢測第二個靶標時，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產生交叉反應。只需變化不同熒光標記即可實現多個靶標的標記。通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現雙重或多重熒光染色

送樣運輸要求：

　　1、樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運輸送樣。

　　切勿固定時間過長，切勿冷凍結冰。

　　2、熒光四標只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。