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信帆生物
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免疫熒光四標(biāo)五色掃描全套(芯片)

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產(chǎn)品型號(hào)

品       牌GEMIG

廠商性質(zhì)其他

所  在  地上海

更新時(shí)間:2024-11-21 11:52:50瀏覽次數(shù):683次

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免疫熒光四標(biāo)五色掃描全套(芯片)
服務(wù)介紹:
免疫熒光四標(biāo)即利用酪胺信號(hào)放大(TSA,Tyramide signal amplification)即TSA技術(shù),在同一張切片上對(duì)四種蛋白同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白空間定位,定性及半定量分析。

免疫熒光四標(biāo)五色掃描全套(芯片)

服務(wù)介紹:

免疫熒光四標(biāo)即利用酪胺信號(hào)放大(TSA,Tyramide signal amplification)即TSA技術(shù),在同一張切片上對(duì)四種蛋白同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記,從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白空間定位,定性及半定量分析。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標(biāo)記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H2O2的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠?biāo)周圍的蛋白酪-氨酸殘基上,此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合。通過(guò)微波處理,非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉,而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍,將靶標(biāo)通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái)。在檢測(cè)第二個(gè)靶標(biāo)時(shí),相當(dāng)于全新的一輪標(biāo)記,無(wú)需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需改變不同種類熒光染料標(biāo)記TSA即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記。通過(guò)多次重復(fù)免疫標(biāo)記,使用不同的熒光酪胺實(shí)現(xiàn)雙重或多重?zé)晒馊旧?/span>

名稱

規(guī)格

免疫熒光四標(biāo)五色掃描全套(芯片)

(包含免疫熒光染色和掃描)

 

 

送樣運(yùn)輸要求:

1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上,常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結(jié)冰,切勿固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

2、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸。

3、熒光四標(biāo)只能做石蠟包埋切片,不能做冰凍切片和細(xì)胞爬片。

實(shí)驗(yàn)大體流程:

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育iF594熒光二抗——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

實(shí)驗(yàn)具體流程:

1、石蠟切片脫蠟至水:依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-無(wú)水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復(fù):組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液( PH 6.0 檸檬酸; PH 9.0 EDTA; PH 8.0 EDTA)的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右,此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定,優(yōu)先推薦 PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液)。

3、畫(huà)圈, 雙氧水封閉:切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈(防止試劑流走),切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min左右,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。

6、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。

7、加iF555-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF555-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

8、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。

9、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。

11、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

13、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。

14、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

15、加第三種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。

16、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織,室溫孵育50min。

17、加iF647-TSA:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF647-TSA,避光室溫孵育10min。 孵育完后,將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

18、微波處理:組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗,此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā),切勿干片。

19、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉,一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

20、加第四種一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。

21、加iF594標(biāo)記的二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的iF594標(biāo)記的熒光二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min。孵育完后,將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

22、DAPI復(fù)染細(xì)胞核:切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。

23、自發(fā)熒光淬滅:切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,流水沖洗10min。

24、封片:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

25、鏡檢成像:切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。

 


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